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Jan 06, 2024

Un análisis exhaustivo de las partículas de meloxicam producidas por ablación con láser de nanosegundos como técnica de molienda en húmedo

Informes científicos volumen 12,

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 12551 (2022) Citar este artículo

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Recientemente, el número de compuestos farmacológicos insolubles en agua y poco solubles ha aumentado significativamente. Por lo tanto, se ha observado un interés creciente en diferentes técnicas de reducción del tamaño de partículas para mejorar las tasas de disolución, las características de transporte y la biodisponibilidad de los fármacos. La ablación con láser ha demostrado ser un método alternativo a la producción de partículas de fármacos de tamaño nanométrico y micrométrico sin un daño químico considerable. Presentamos la ablación con láser de nanosegundos de pastillas de fármaco en agua destilada, dirigida al meloxicam, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo poco soluble en agua, a diferentes longitudes de onda del láser (248 nm, 532 nm y 1064 nm). Además de los estudios de caracterización química, cristalinidad, morfología y tamaño de partículas, se examinó el mecanismo del proceso de generación de partículas. La aplicabilidad de las partículas ablacionadas en la formulación de fármacos se investigó mediante mediciones de la solubilidad, la citotoxicidad y el efecto antiinflamatorio. Demostramos que la ablación con láser es un método limpio, eficiente y químicamente no dañino para reducir el tamaño de las partículas de meloxicam al rango de tamaño de submicrómetros a unos pocos micrómetros, que es óptimo para la administración de fármacos pulmonares. Complementada por la excelente solubilidad (de cuatro a nueve veces mayor) y las propiedades antiinflamatorias (de cuatro a cinco veces mejores) de las partículas en comparación con el fármaco inicial, se prevé que la ablación con láser tenga aplicaciones más amplias en el desarrollo de formulaciones de fármacos.

La solubilidad es una preocupación creciente para la industria farmacéutica, ya que los fármacos poco solubles representan alrededor del 40 % de los compuestos comercializados y el 90 % de los candidatos1. Esta tendencia inspiró el desarrollo de diversas estrategias de formulación y administración de fármacos2. Uno de los métodos físicos más sencillos para aumentar la solubilidad y la biodisponibilidad es la reducción del tamaño de las partículas3,4, cuyas técnicas se pueden clasificar5 como a) convencionales: molienda6,7, secado por aspersión8, homogeneización a alta presión7 o b) no convencionales: anticongelantes líquidos. -cristalización con disolventes9, liofilización por pulverización10, procesos de micronización basados ​​en fluidos supercríticos11 y ablación con láser pulsado12,13,14,15.

La ablación con láser pulsado es una técnica de procesamiento de materiales flexible que se puede utilizar en vacío, gas o líquido con diversos materiales objetivo. Se aplica ampliamente para sintetizar diferentes nanomateriales16,17,18,19. Dado que la ablación con láser es una técnica libre de productos químicos que se puede controlar con precisión en una amplia gama de parámetros, también se ha vuelto atractiva para las ciencias de la vida. Se demostró que las partículas del fármaco podían triturarse mediante ablación con láser, reduciendo así el tamaño de las partículas originales (sintetizadas) hasta el rango de tamaño de nanómetros a micrómetros12,13,14,15.

El presente trabajo complementa nuestra investigación previa sobre la producción de suspensión de meloxicam mediante ablación con láser pulsado en líquido (PLAL)12. Se utilizaron tres longitudes de onda de láser diferentes y, además de la estructura y composición de las partículas ablacionadas, se estudiaron y compararon con el fármaco original su solubilidad, citotoxicidad y actividad antiinflamatoria. Para comprender el proceso subyacente, rastreamos la ablación de las pastillas de fármaco mediante fotografía rápida.

Meloxicam (Mx.) (4-hidroxi-2-metil-N-(5-metil-2-tiazolil)2H-benzotiazina-3-car-boxamida-1,1-dióxido) se obtuvo de EGIS Ltd., (Budapest , Hungría) en forma de polvo 100 % cristalino con un grado farmacéutico superior al 99 % y un tamaño medio de partícula de d(0,5) = 27,52 µm.

Los objetivos de meloxicam puro se produjeron comprimiendo 300 mg de polvo de meloxicam en pastillas con un diámetro de 9 mm utilizando una fuerza de compactación de 15 kN en una prensa de tabletas KORSCH EK-0 (KORSCH AG, Berlín, Alemania).

Un láser excimer KrF (LLG Twinamp, λ = 248 nm, FWHM = 18 ns, f = 10 Hz) y un láser Nd:YAG de conmutación Q de doble frecuencia (Quantel, λ = 532 nm/1064 nm, FWHM = 6 ns, f = 10 Hz) proporcionó los pulsos de nanosegundos en tres longitudes de onda desde el ultravioleta hasta la región visible e infrarroja.

La configuración fue la misma para las tres longitudes de onda (Fig. 1): el rayo láser se transmitió a través de una lente de sílice fundida y se enfocó justo debajo de la superficie del objetivo colocado en un vaso de precipitados giratorio que contenía 10 ml de agua destilada. La superficie objetivo estaba aproximadamente 5 mm por debajo del nivel del agua. El tamaño del punto fue de ~0,6 mm2 y la energía del pulso fue de ~60 mJ a λ = 532 nm/1064 nm, y de ~0,3 mm2 y ~30 mJ a λ = 248 nm, respectivamente. La fluencia de ablación fue de 9,4 J/cm2 en todos los casos y, dependiendo de la cantidad de partículas ablacionadas requeridas para una medición en particular, se utilizaron aproximadamente 36.000 o 72.000 pulsos de láser. Después de la ablación, la suspensión resultante se filtró a través de un tamiz (tamaño de poro de 300 µm) para eliminar los fragmentos de las pastillas de modo que no distorsionaran el análisis de las partículas ablacionadas con láser.

Montaje experimental para ablación con láser pulsado en líquido (PLAL).

El contenido de agua de la suspensión se evaporó a 50 °C en un horno de laboratorio (CARBOLITE 2416, Thermal Engineering Services Ltd., Worcester, Inglaterra) dentro de las 12 h, y el polvo restante se usó para la preparación de muestras FTIR. Unos pocos mg de las partículas secas se mezclaron con 150 mg de KBr, y esta mezcla se molió en un mortero de acato y se prensó en un disco con un diámetro de 13 mm a 10 kN para el análisis FTIR.

Los espectros FTIR se registraron con un espectrómetro FTIR AVATAR 330 (Thermo Nicolet, LabX Midland, ON, Canadá) entre 4000 y 400 cm−1, con una resolución de 4 cm−1 y un promedio de 128 escaneos/medida usando la corrección de línea base.

Para los estudios de espectroscopia Raman, se utilizó una pequeña cantidad del mismo polvo seco que para las mediciones FTIR. El microscopio Raman Thermo Scientific™ DXR™ (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE. UU.) se operó a una longitud de onda láser de λ = 780 nm para excitación a una potencia láser de 2 mW y con un tamaño de punto de aproximadamente 3,1 µm. Los espectros Raman se registraron en el rango de número de onda de 2500 y 500 cm−1 utilizando una rejilla de 400 líneas/mm. La resolución fue de 4,7 a 8,7 cm−1. Todos los espectros se registraron 20 veces con un tiempo de integración de 2 s.

Se utilizó HPLC-MS para la separación e identificación de los productos de ablación. Después de la ablación, la suspensión resultante se concentró a 1–2 ml por evaporación en un horno de laboratorio a 50 °C. Luego, las partículas sólidas se disolvieron agregando 5 ml de acetonitrilo. Antes del análisis HPLC-MS, cada muestra se filtró a través de un filtro de jeringa (diámetro medio de poro: 0,22 µm).

El sistema HPLC Agilent 1100 estaba equipado con un detector de matriz de diodos (DAD) y un espectrómetro de masas (MS) Agilent LC/MSD/VL (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EE. UU.). La separación se realizó utilizando una columna Kinetex 2,6u XB-C18 100A (Phenomenex), termostatizada a 35 °C. El eluyente consistió en metanol al 40% v/v y agua al 60% v/v con ácido fórmico (0,1% v/v) (caudal 0,80 ml min-1). Las longitudes de onda de detección fueron 210 nm y 350 nm. Las mediciones de MS se realizaron utilizando ionización por electropulverización (ESI) en modo de iones positivos, gas de secado de nitrógeno a 300 °C, voltaje de capilar de 3500 V y voltaje de fragmentador de 50 V. La concentración de meloxicam de las suspensiones se determinó por HPLC-MS, utilizando la curva de calibración. La curva de calibración de primer orden (R2 = 0,991) se determinó con soluciones de meloxicam puro en el rango de 50 a 500 mg/dm3.

Para los estudios de cristalinidad se utilizó el polvo obtenido de la suspensión después de secar a 50 °C durante 12 h. Empleamos un difractómetro de rayos X en polvo BRUKER D8 Advance (Bruker AXS GmbH, Karlsruhe, Alemania) con radiación Cu K λI (λ = 1.5406 Å) y un detector VÅNTEC-1, escaneando las muestras a 40 kV y 40 mA, con un 2θ rango angular de 3° a 40°, a una velocidad de exploración de 0,1 s/paso y un tamaño de paso de 0,0074°.

La morfología y el tamaño de partícula se estudiaron mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). Después de la ablación, se colocó una gota de la suspensión agitada sobre una placa de silicona. Antes de la formación de imágenes, la gota se secó y luego se recubrió con oro utilizando un recubridor por pulverización (Bio-Rad SC 502, VG ​​Microtech, Uckfield, Reino Unido). Los estudios SEM se realizaron con un sistema SEM Hitachi S-4700 (Hitachi S4700, Hitachi Scientific Ltd., Tokio, Japón).

Para describir el proceso de generación de partículas, construimos un sistema de bomba-sonda adecuado para fotografía rápida (Fig. 2).

Configuración de sonda de bomba para fotografía rápida con iluminación de sonda directa (línea de puntos azul) o extendida con un interferómetro de Michelson para exposición doble con dos pulsos de sonda.

Las imágenes SEM implicaban que el proceso de fabricación de partículas era independiente de la longitud de onda de la ablación. Para las investigaciones, se eligió un láser Nd:YAG (Quantel, λ = 532 nm/1064 nm, FWHM = 6 ns) como fuente de bombeo (ablación). A λ = 532 nm, el tamaño del punto fue de ∼0,2–0,3 mm2 y las energías de pulso fueron de ∼6–8 mJ y ∼12–16 mJ, lo que resultó en fluencias F = 3 J/cm2 y F = 6 J/cm2, respectivamente . A λ = 1064 nm, el tamaño del punto fue de ~0,07–0,09 mm2 y la energía del pulso fue de ~15 mJ, lo que resultó en una fluencia de F = 18 J/cm2. (El tamaño del punto se redujo en comparación con los experimentos de generación de muestras para encajar en el campo de visión). Como haz de sonda, se utilizó un láser de colorante rodamina 6G inducido por láser de nitrógeno (λ = 590 nm, FWHM = 1 ns). El rayo láser de la sonda fue transportado a la configuración de ablación por una fibra óptica y enviado directamente al objetivo oa través de un interferómetro de Michelson que proporcionó dos pulsos de sonda consecutivos con una separación de tiempo de 8 ns. La iluminación directa se utilizó para investigar la evolución temporal de la generación de partículas, mientras que el propósito de utilizar dos pulsos de sonda fue estudiar la parte transitoria inicial del proceso de ablación. El tiempo de retardo entre la bomba y el primer pulso de la sonda se controló mediante un fotodiodo. Los pulsos de la bomba alcanzan el objetivo desde arriba, mientras que los pulsos de la sonda proporcionan iluminación lateral (tangencial a la superficie iluminada), proyectando una imagen sombreada del proceso de ablación en una cámara CCD (The Imaging Source-DMK 23G445, 30 fps, N = 3 ×). La luz del plasma generado fue filtrada por un filtro óptico de paso de banda colocado frente a la cámara. La activación separada de la bomba y los láseres de sonda y la cámara CCD con retrasos en el rango de nanosegundos a milisegundos fue controlada por un generador de retraso digital (DDG) (Stanford Research Systems-DG645).

Las medidas de solubilidad se realizaron a temperatura ambiente (22 °C), durante un tiempo de 24 h, en 10 ml de solución tampón fosfato (pH = 7,4), utilizando una sonda AvaSpec-2048L y un espectrofotómetro AvaLight DH-S-BAL ( Avantes, Apeldoorn, Países Bajos). Cada solución de muestra se filtró (diámetro de poro medio del filtro: 0,45 µm), y después de la dilución requerida, se midió la absorbancia a λ = 362 nm y se calculó la concentración de meloxicam.

Después de secar las suspensiones (50 °C, 12 h), se resuspendió 1 mg del residuo sólido en 1 ml de medio esencial mínimo Eagle con sales de Earle (Sigma, St Louis, MO, EE. UU.), suplementado con 10 % vol. /vol de suero de ternero fetal, glucosa al 0,5% p/vol, 0,3 mg de l-glutamina ml-1, HEPES 4 mM y 25 µg de gentamicina ml-1.

Para caracterizar la viabilidad celular, se midió la actividad mitocondrial utilizando un ensayo de bromuro de MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio). Durante estos experimentos, se usaron A549 (células epiteliales basales alveolares humanas adenocarcinómicas) (ATCC) y se sembraron a una densidad de 4∙104 células/pocillo. Las células se trataron con una muestra que contenía partículas producidas por ablación con láser de pastillas de meloxicam a longitudes de onda de 248, 532 o 1064 nm. Se preparó una dilución en serie doble de los compuestos con una concentración máxima del compuesto de 1 mg/ml, y se determinó la citotoxicidad con un tiempo de incubación de 24 h a 37 °C. Como paso siguiente, se añadieron a cada pocillo 20 μl de bromuro de tetrazolio azul de tiazolilo (MTT; Sigma, St. Louis, Missouri, EE. UU.). Después de una incubación adicional durante 4 h a 37 °C, se añadió solución de dodecilsulfato de sodio (Sigma, St. Louis, Missouri, EE. UU.) (10 % en HCl 0,01 M) y se incubó durante la noche. Finalmente, la citotoxicidad se determinó mediante medidas de densidad óptica (OD) a 550 nm (referencia: 630 nm) utilizando un lector ELISA EZ READ 400 (Biochrom, Cambridge, Reino Unido). En cada concentración, el ensayo se repitió cuatro veces. La viabilidad celular se concluyó en base a la siguiente fórmula: \({1}00 - \left( {\left( {{\text{OD}}_{{{\text{muestra}}}} - {\text{OD }}_{{{\text{medio}}\;{\text{ control}}}} } \right) / \left( {{\text{OD}}_{{{\text{cell }}\ ;{\text{control}}}} - {\text{OD}}_{{{\text{medio}}\;{\text{control}}}} } \right)} \right) \times { 1}00\) .

Para observar el efecto antiinflamatorio, se sembraron células A549 en placas de 6 pocillos a una densidad de 1∙106 células/pocillo y se trataron con una mezcla de 5 µg/ml de lipopolisacárido (LPS; ThermoFisher Scientific Waltham, MA, EE. UU.) y las soluciones de las partículas ablacionadas o tratadas con 5 µg/ml de LPS (control positivo) o dejadas sin tratar. La concentración de partículas en las soluciones se eligió como la concentración máxima no tóxica, que se ha determinado con las medidas de citotoxicidad descritas en la sección anterior. Las concentraciones no tóxicas se midieron como 0,125 mg/ml, 0,016 mg/ml y 0,125 mg/ml para partículas producidas por ablación a 248 nm, 532 nm y 1064 nm, respectivamente.

El ARN se extrajo después de 24 h de tratamiento utilizando el reactivo TRI (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Posteriormente, 2 µg de ARN se transcribieron inversamente utilizando Maxima Reverse Transcriptase de acuerdo con el protocolo del fabricante, aplicando cebadores Random Hexamer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.).

Para qPCR, se utilizó un sistema en tiempo real Bio-Rad CFX96 con 5 × HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Supermix (Solis BioDyne, Tartu, Estonia) y los pares de cebadores específicos para humanos enumerados: IL-6: 5'-CAGCTATGAACTCCTTCTCCAC- 3' y 5'-GCGGCTACATCTTTTGGAATCT-3'; Actb: 5'-TTCTACAATGAGCTGCGTGTGGCT-3' y 5'-TAGCACAGCCTGGATAGCAACGTA -3' Los cebadores se diseñaron con el software Primer Quest Tool y se sintetizaron por Integrated DNA Technologies Inc. (Montreal, Quebec, Canadá). Para verificar la especificidad de la amplificación, se realizó un análisis de la curva de fusión. Se determinaron los ciclos umbral (Ct) para IL-6 y Actb, y se calculó la expresión génica relativa con el método 2-(ΔΔCt). Se aplicó un análisis de varianza unidireccional con mediciones repetidas (ANOVA RM) y comparaciones planificadas para comparar las diferencias estadísticas en los valores de log2 (ΔΔCt) entre las muestras tratadas y de control, como se detalló anteriormente, con un nivel de significación de P < 0,0520.

Después del tratamiento durante 24 h, se recolectó el sobrenadante de las células y se determinó la concentración de IL-6 usando los kits ELISA de IL-6 humana tipo sándwich estándar Legend Max™ (BioLegend, San Diego, California, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El sobrenadante de las células tratadas con LPS se diluyó 10 ×. El kit tenía un rango dinámico entre 7,8 y 500 pg/ml. Para el análisis de las placas se utilizó un lector de microplacas Biochrom Anthos 2010 (Biochrom, Cambridge, Reino Unido). Las muestras se analizaron por duplicado.

Se realizaron estudios FTIR, Raman y HPLC-MS para determinar la composición química de las partículas producidas por ablación láser.

Al comparar las regiones de huellas dactilares (1800–400 cm−1), encontramos que los espectros FTIR de las partículas ablacionadas eran idénticos al espectro de meloxicam de referencia (Mx. ref.) para todas las longitudes de onda del láser de ablación (Fig. 3): la característica los picos aparecieron en los números de onda esperados y las proporciones de intensidad de los picos fueron las mismas.

Región de huellas dactilares de los espectros FTIR de las partículas preparadas por PLAL a diferentes longitudes de onda (248 nm, 532 nm, 1064 nm) y el meloxicam (Mx. ref.). Todos los espectros se normalizaron al pico en ~ 1550 cm−1.

De manera similar, los espectros Raman de las partículas generadas con PLAL coincidieron con el espectro del polvo de meloxicam inicial (Mx. ref.) para todas las longitudes de onda aplicadas (Fig. 4). Por lo tanto, los resultados de Raman coincidieron con los resultados de FTIR.

Espectros Raman de las partículas preparadas por PLAL a diferentes longitudes de onda (248 nm, 532 nm, 1064 nm) y el meloxicam (Mx. ref.). Todos los espectros se normalizaron al pico en ~ 1530 cm−1.

También analizamos el material ablacionado por HPLC-MS para identificar los productos y sus cantidades relativas.

En todas las longitudes de onda, la mayor parte del material producido por ablación fue meloxicam. En los espectros de masas, además del meloxicam (C14H13N3O4S2, Fig. 5a) encontramos el producto C4H6N2S (Fig. 5b), que se conoce como impureza de meloxicam B21,22,23. La impureza B de meloxicam es una sección de la molécula de meloxicam y está clasificada como estándar primario farmacéutico24,25. Para las tres longitudes de onda de ablación, el área máxima de Mx. la impureza B era menos del 5% del área del pico de meloxicam (Fig. 5c). Además, al menos tres productos presumiblemente aromáticos estaban presentes con áreas de pico relativamente pequeñas.

La estructura química y la masa de iones de (a) meloxicam y (b) impureza B de meloxicam. (c) Las áreas máximas relativas de la impureza B de meloxicam en comparación con meloxicam [(AreaImpurity/AreaMeloxicam) × 100%] y (d) las concentraciones de meloxicam (determinado por el método HPLC-MS) en el caso de las longitudes de onda investigadas (248 nm, 532 nm, 1064 nm).

Después de disolver todas las partículas en las suspensiones obtenidas por ~ 36.000 pulsos de láser en cada longitud de onda, se midió la concentración de meloxicam en 203,56 ± 27,30, 246,32 ± 58,57 y 242,92 ± 4,90 mg/dm3 para longitudes de onda de láser de 248 nm, 532 nm y 1064 nm , respectivamente (Fig. 5d). Estas concentraciones muestran que el rendimiento de meloxicam es del mismo orden de magnitud en todas las longitudes de onda aplicadas.

Analizamos la cristalinidad de las partículas producidas por espectroscopia de difracción de rayos X (Fig. 6). El patrón XRPD de nuestras muestras coincidió con los espectros del polvo de meloxicam original (Mx. ref.), lo que indica que la ablación no cambió la estructura cristalina. Esto demostró que las partículas generadas por ablación con láser tenían aproximadamente el mismo índice de cristalinidad que el polvo de meloxicam comercializado.

Espectros XRPD de las partículas preparadas por PLAL a diferentes longitudes de onda (248 nm, 532 nm, 1064 nm) y el meloxicam (Mx. ref.). Los espectros se normalizaron al pico a 25,94°.

La morfología y el tamaño de las partículas fueron investigados por SEM, y algunas imágenes típicas se muestran en la Fig. 7. Las partículas generadas por PLAL se parecían a piezas de cristal trituradas, lo que indica que la fragmentación mecánica podría ser el efecto de reducción de tamaño relevante. En el caso de la ablación UV (λ = 248 nm), las islas de material recristalizado formaron una estructura similar a una película sobre la placa de silicio.

Imágenes SEM del polvo de meloxicam comercialmente disponible (Mx. ref.) y las partículas generadas por PLAL a 248 nm, 532 nm y 1064 nm. Ampliación: (a)–(d): 500; (e)–(h): 1k; (i)–(l): 10k.

En comparación con el polvo de meloxicam comercialmente disponible, se logró una reducción de tamaño significativa en todas las longitudes de onda investigadas. El tamaño de las partículas ablacionadas osciló entre unos pocos cientos de nanómetros y unos pocos micrómetros. Se realizó un análisis cuantitativo utilizando el software QuPath-0.3.1. La evaluación fue un desafío porque las partículas se agruparon en montones y se superpusieron durante el secado de las gotas. Por lo tanto, los límites de partículas se determinaron individualmente en las imágenes SEM. Se analizó un área de imagen de alrededor de 10 mm2 en el caso de cada muestra. A modo de aproximación, después de determinar el área cubierta por cada partícula, se asignaron círculos de igual área a las partículas delineadas en las imágenes, y el diámetro de cada círculo se utilizó como parámetro característico del tamaño de partícula al trazar el diagrama de distribución de tamaño ( figura 8).

Distribución del tamaño de las partículas generadas por ablación láser a longitudes de onda de 248 nm, 532 nm y 1064 nm. (Tenga en cuenta las diferentes escalas en el eje y).

Como se propuso anteriormente12, la producción de partículas de meloxicam mediante ablación con láser pulsado en líquido puede describirse mediante la siguiente secuencia de pasos: 1. la energía del pulso se absorbe en un pequeño volumen de la capa superficial del objetivo; 2. hay un aumento intenso y rápido de la temperatura, y el meloxicam se evapora y se descompone en el volumen superior, lo que da como resultado una liberación de gas explosiva y una expansión del plasma; 3. Surgen fuerzas de retroceso que arrancan partículas parcialmente fundidas y sólidas de la superficie restante. Si las partículas se acumulan en el medio líquido, existe la posibilidad de fragmentación "secundaria", cuando las partículas ya dispersas son irradiadas por los pulsos de láser. En nuestro caso este efecto podría no ser significativo debido a la baja concentración de partículas y además la fluencia alcanza el umbral de ablación solo cerca del foco.

El período de tiempo entre 50 ns y 2 ms después del impacto del pulso láser se investigó usando pulsos de bomba de λ = 532 nm e iluminación de sonda directa. Para minimizar el brillo del plasma, tratamos de encontrar la fluencia más baja posible en la que ya se puede observar la formación de partículas.

Para fines de demostración, a 3 J/cm2 solo era visible el frente de onda inducido por el plasma en expansión, y no hubo eyección de material (Fig. 9).

Imágenes de fotografía rápida de ablación con láser pulsado (λ = 532 nm, F = 3 J/cm2) de meloxicam en agua destilada.

Después de evaluar las imágenes con ImageJ, trazamos la distancia del frente de onda desde la superficie a lo largo del tiempo (Fig. 10) y ajustamos los puntos de datos con una función lineal. Para la pendiente obtuvimos v = 1490,0 ± 9,5 m/s, que está solo ligeramente por encima de la velocidad de propagación del sonido en el agua: vw = 1480 m/s (T = 20 °C), lo que indica que las ondas observadas eran más bien acústicas que ondas de choque Esto significa que incluso si hubo ondas de choque iniciales inducidas por el plasma en expansión, disminuyeron rápidamente.

Distancia del frente de onda desde la superficie de la pastilla en función del tiempo. Los puntos de datos son de las mediciones de fotografía rápida (λ = 532 nm, F = 3 J/cm2).

Intentamos aumentar la vida útil de la onda de choque elevando la fluencia a 6 J/cm2, pero aún no se detectó ninguna onda de choque. Por otro lado, presenciamos una intensa eyección de material.

Podemos distinguir tres etapas principales en el proceso de ablación con láser pulsado en agua, que se aprecian claramente en las imágenes de fotografía rápida (Fig. 11). En los primeros cientos de nanosegundos, un frente de onda se propaga en el medio (Fig. 11a-c). El frente principal es la suma de numerosas ondas pequeñas que se originan en varias fuentes puntuales en la superficie objetivo. También se puede ver la interferencia de estas ondas y su dispersión sobre algunas partículas expulsadas. Además, los cambios en el índice de reflexión del medio debido a un aumento de la temperatura también podrían contribuir a las franjas detrás del frente de onda principal.

Imágenes de fotografía rápida de PLAL (λ = 532 nm, F = 6 J/cm2) de meloxicam en agua destilada. (a)–(c) Formación y propagación del frente de onda; ( d ) - ( g ) Dinámica de rebote de la burbuja de cavitación con el aumento de la eyección de partículas; (h) Desintegración de la burbuja de cavitación y liberación/dispersión de partículas en el agua.

La segunda etapa dura desde unos pocos microsegundos hasta unos pocos cientos de microsegundos e involucra la formación y los cambios de tamaño de la burbuja de cavitación (Fig. 11d-g). Este rebote repetido de la burbuja de cavitación se ha descrito previamente en el marco de la dinámica de burbujas para la formación de nanopartículas de metal (cobre) por ablación láser en líquido26. Las partículas generadas se encuentran principalmente dentro de la burbuja de cavitación, pero a medida que la burbuja pulsa, se expulsan más y más partículas. Aparecen pequeñas burbujas de gas que suben a la superficie del líquido solas o, a veces, con partículas adheridas. Contrariamente a una publicación anterior27, la presencia de burbujas de gas persistentes no es típica en nuestra configuración, quizás debido a la menor frecuencia de ablación aplicada.

Finalmente, en la tercera etapa, después de algunos milisegundos, la burbuja de cavitación se rompe en burbujas más pequeñas que suben a la superficie del agua y todas las partículas atrapadas en la burbuja de cavitación se dispersan en el agua (Fig. 11h). Se presentó un mecanismo similar para varios objetivos y líquidos28,29,30.

Optimizamos la configuración y la configuración para poder detectar las ondas de choque iniciales. Desde la fibra óptica, el pulso de la sonda se condujo al interferómetro de Michelson proporcionando dos pulsos de sonda con una separación de tiempo fija. Este arreglo nos permitió estimar la velocidad de propagación con mayor precisión. Para evitar cualquier superposición de los pulsos de láser de la bomba y la sonda y para minimizar la luz dispersa que interfiere, se aplicó el rayo láser λ = 1064 nm como bomba. Aumentamos la fluencia hasta que aparecieron las ondas de choque. La ablación degradó rápidamente la superficie, por lo que tuvimos que mover el objetivo entre disparos de ablación consecutivos para proporcionar una superficie fresca. Además, la fluctuación del tiempo, la porosidad del objetivo y la ligera variación de la energía del pulso láser contribuyeron a un cierto grado de incertidumbre en el análisis cuantitativo.

La Figura 12 presenta imágenes tomadas con esta configuración optimizada y captura las fases iniciales de formación de ondas de choque y la aparición de la burbuja de cavitación. Con el tiempo, debido al esquema de imagen específico, parece como si dos frentes de onda se estuvieran propagando con una separación espacial decreciente. La burbuja de cavitación emerge y crece.

Imágenes de fotografía rápida de ablación con láser pulsado (λ = 1064 nm, F = 18 J/cm2) de meloxicam en agua destilada. (a)–(f) Formación y propagación del frente de onda doblemente expuesto en dos momentos con t = 8 ns de separación de tiempo; (c)–(f) Generación y cambios de tamaño de la burbuja de cavitación.

Utilizando ImageJ, se midió la separación/distancia espacial (x) de los frentes de onda en cada imagen. El interferómetro de Michelson introdujo una separación de tiempo = 8 ns entre los dos pulsos de sonda. En un momento dado después del impacto del pulso de la bomba, dividiendo la distancia actual por el tiempo fijo de separación, podríamos calcular la velocidad de propagación promedio del frente de onda entre los dos momentos registrados con los pulsos de la sonda (Fig. 13). Los puntos de datos muestran que la velocidad de propagación promedio va más allá de la velocidad del sonido en el agua (vw) y luego sigue una tendencia decreciente con el tiempo, acercándose gradualmente a vw = 1480 m/s. Como la onda de choque abandonó el campo de visión, no pudimos obtener ningún dato de velocidad después de un retraso de 200 ns, donde la saturación parece ser de alrededor de 1550 m/s (Fig. 13). Sin embargo, sobre la base de las medidas de propagación del frente de onda presentadas en la Fig. 10, podemos suponer que al final la saturación será de alrededor de vw = 1480 m/s. En conclusión, la onda de choque inicial se convierte en una onda acústica en unas pocas decenas o cientos de nanosegundos, dependiendo de la fluencia aplicada.

Dependencia temporal de la velocidad de propagación del frente de onda producido por PLAL (λ = 1064 nm, F = 18 J/cm2) de meloxicam en agua destilada.

Los estudios de solubilidad mostraron que se podía disolver una mayor cantidad de meloxicam en la solución tampón de las partículas preparadas con el método PLAL que del polvo de meloxicam original en el caso de todas las longitudes de onda láser aplicadas (Fig. 14).

Datos de solubilidad del meloxicam comercialmente disponible (Mx. ref.) y las muestras producidas con diferentes longitudes de onda de ablación (248 nm, 532 nm, 1064 nm).

En comparación con la concentración de saturación del meloxicam de referencia (0,043 mg/ml), se midió un aumento de nueve, cuatro y ocho veces en la concentración de saturación cuando se disolvieron las partículas de meloxicam producidas por PLAL a 248 nm, 532 nm y 1064 nm. Cuantitativamente, esto resultó en concentraciones de saturación de 0,388 ± 0,0605 mg/ml (para λ = 284 nm), 0,163 ± 0,004 mg/ml (para λ = 532 nm) y 0,327 ± 0,026 mg/ml (para λ = 1064 nm).

El límite no tóxico se definió como la concentración más alta que aún asegura el 100 % de viabilidad celular. La dosis terapéutica de meloxicam en los medicamentos comercializados es de 7,5 o 15,0 mg por vía oral y se recomienda 1/10 de esta dosis para administración pulmonar 31,32, por lo que se seleccionó la concentración de 1 mg/ml como concentración máxima para los estudios de citotoxicidad. El meloxicam de referencia no mostró toxicidad a concentraciones inferiores a 0,125 mg/ml. Las mediciones de citotoxicidad mostraron que las muestras generadas por PLAL a λ = 248 nm y 1064 nm no tuvieron un efecto citotóxico medible por debajo de 0,125 mg/ml, mientras que en el caso de λ = 532 nm, el límite no tóxico fue de alrededor de 0,016 mg/ml (Fig. . 15). Las muestras producidas por PLAL a λ = 248 nm y 1064 nm estaban en el mismo rango de citotoxicidad que el meloxicam de referencia, mientras que el compuesto generado con λ = 532 nm fue el más citotóxico. Estas concentraciones no tóxicas determinadas se usaron en las mediciones antiinflamatorias.

Viabilidad celular en el caso de las longitudes de onda de ablación investigadas (248 nm, 532 nm, 1064 nm).

Para probar el efecto antiinflamatorio, se utilizó LPS, un fuerte agente proinflamatorio para aumentar la producción de IL-6 de las células A54933. Al medir el contenido de IL-6 después del tratamiento con las muestras de fármacos producidos con PLAL, pudimos describir y comparar sus efectos antiinflamatorios. El LPS añadido elevó significativamente la expresión relativa de IL-6 en comparación con el grupo no tratado. La expresión relativa de IL-6 se cuadruplicó en el caso de células tratadas con LPS (4,2 ± 0,2) en comparación con las células no tratadas (1,1 ± 0,2). Al comparar la expresión relativa de IL-6 en células tratadas con LPS + fármaco y células tratadas solo con LPS, encontramos que se podía lograr una disminución moderada (∼25%) agregando UV (λ = 248 nm) e IR ( λ = 1064 nm) la ablación con láser produjo muestras, y una reducción significativa (∼75 %) al agregar la muestra de ablación con láser VIS (λ = 532 nm) (Fig. 16a). Cuantitativamente, esto dio como resultado expresiones relativas de IL-6 de 3,1 ± 1,5 para UV, 0,8 ± 0,4 para VIS y 2,8 ± 1,1 para IR.

(a) Expresión relativa y (b) concentración de IL-6 en el caso de células A549 no tratadas (sin tratar), células A549 tratadas con LPS (LPS), células A549 tratadas con LPS y suspensión de meloxicam generada por ablación con láser en las respectivas longitudes de onda (LPS + 248 nm, LPS + 532 nm y LPS + 1064 nm). En el caso de la concentración de IL-6 (b), también se presentan los datos de células A549 tratadas con LPS y suspensión de meloxicam de referencia (LPS + Mx. ref.).

Para determinar si estos niveles de expresión relativa se correlacionaban con los niveles de proteína, se realizaron mediciones ELISA para medir las concentraciones de IL-6 en los sobrenadantes (Fig. 16b). En el grupo no tratado no hubo un nivel medible de IL-6. En comparación con las células no tratadas (0,0 ± 0,0 pg/ml), la concentración de IL-6 aumentó significativamente como resultado del tratamiento con LPS (hasta 49,4 ± 7,3 pg/ml). Cuando se añadió meloxicam de referencia a las células tratadas con LPS, la concentración de IL-6 disminuyó un 20 % (a 39,9 ± 2,9 pg/ml) en comparación con las células tratadas solo con LPS. Después del tratamiento con LPS, la adición de muestras ablacionadas con láser redujo considerablemente las concentraciones de IL-6: en un 89 % (a 5,6 ± 2,9 pg/ml), 95 % (a 2,5 ± 0,4 pg/ml) y 78 % (a 10,7 ± 0,8 pg/ml) utilizando láseres UV, VIS e IR, respectivamente. En función de la disminución de la concentración de citoquinas IL-6, todas las muestras producidas con PLAL mostraron un efecto antiinflamatorio significativo, mucho más fuerte que el meloxicam de referencia. Según las mediciones, la muestra generada con λ = 532 nm tenía las mejores propiedades antiinflamatorias a pesar de la dosis más baja requerida según las mediciones de citotoxicidad.

La ablación con láser pulsado de meloxicam en agua destilada ha demostrado ser una técnica de reducción del tamaño de partículas eficaz y libre de productos químicos en las tres longitudes de onda investigadas.

Los estudios de FTIR, espectroscopia Raman y HPLC-MS mostraron que la descomposición química fue insignificante durante la ablación. La impureza B de meloxicam estaba presente en una cantidad relativamente pequeña. Las partículas mantuvieron su cristalinidad durante todo el proceso y su morfología se asemejaba a la de los cristales rotos. El tamaño inicial de ~ 30 µm de las partículas de meloxicam podría reducirse al rango de tamaño entre unos pocos cientos de nanómetros y unos pocos micrómetros, óptimo para la administración pulmonar. El análisis fotográfico rápido confirmó que la trituración mecánica es el proceso principal que conduce a la reducción del tamaño de las partículas. La aplicabilidad farmacéutica está respaldada por el aumento significativo (nueve, cuatro y ocho veces) de la solubilidad de las muestras ablacionadas en las respectivas longitudes de onda de ablación. A pesar del efecto citotóxico similar (∼0,125 mg/ml a λ = 248 y 1064 nm) o mayor (∼0,016 mg/ml a λ = 532 nm) de las suspensiones producidas por PLAL, el efecto antiinflamatorio fue excelente (IL-6 la concentración disminuyó en un 89, 95, 78% a λ = 248, 532, 1064 nm, respectivamente) y superó ampliamente la del meloxicam de referencia.

En base a la solubilidad, citotoxicidad y propiedades antiinflamatorias obtenidas, esperamos que se pueda lograr el mismo efecto terapéutico con una dosis de fármaco significativamente menor mediante el uso de partículas trituradas mediante la técnica PLAL.

Por lo tanto, las partículas de meloxicam generadas por ablación con láser pulsado en agua destilada podrían ser adecuadas para administración oral o pulmonar. Alternativamente, el meloxicam suspendido en agua podría transformarse en un producto intermedio sólido para la preparación de diferentes formas farmacéuticas (tabletas, cápsulas o inhaladores de polvo seco, etc.).

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Este trabajo fue apoyado por el Nuevo Programa Nacional de Excelencia ÚNKP-21-3-SZTE-446 del Ministerio de Innovación y Tecnología de la fuente del Fondo Nacional de Investigación, Desarrollo e Innovación. Proyecto No. TKP2021-EGA-32 se ha implementado con el apoyo proporcionado por el Ministerio de Innovación y Tecnología de Hungría del Fondo Nacional de Investigación, Desarrollo e Innovación, financiado bajo el esquema de financiación TKP2021-EGA-32.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Universidad de Szeged. El financiamiento fue proporcionado por el Fondo de Acceso Abierto de la Universidad de Szeged, número de subvención 5722.

Departamento de Óptica y Electrónica Cuántica, Universidad de Szeged, Dóm tér 9, Szeged, 6720, Hungría

Eszter Nagy, Zsolt Homik, Tamás Smausz, Judit Kopniczky y Béla Hopp

Departamento de Química Inorgánica y Analítica, Universidad de Szeged, Dóm tér 7, Szeged, 6720, Hungría

Máté Náfrádi & Tünde Alapi

Departamento de Microbiología Médica, Facultad de Medicina Albert Szent-Györgyi, Universidad de Szeged, Dóm tér 10, Szeged, 6720, Hungría

David Kokai y Katalin Burián

Instituto de Tecnología Farmacéutica y Asuntos Regulatorios, Universidad de Szeged, Eötvös utca 6, Szeged, 6720, Hungría

Piroska Szabó-Révész y Rita Ambrus

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EN llevó a cabo los experimentos de ablación y las mediciones FTIR. EN y Zs.H. fueron responsables de las mediciones y cálculos rápidos de la fotografía. TS proporcionó soporte técnico. JK y EN realizaron, analizaron y visualizaron investigaciones SEM y Raman. MN realizó, y MN y TA analizaron las mediciones de HPLC-MS. DK llevó a cabo y analizó la citotoxicidad y las investigaciones antiinflamatorias con la supervisión de KB. P.Sz.R. y RA proporcionó las medidas de solubilidad y XRPD y apoyó los antecedentes farmacéuticos del artículo. BH proporcionó la conceptualización y la supervisión. EN escribió el texto principal del manuscrito y preparó las figuras. Todos los autores participaron en la revisión y edición del manuscrito y aprobaron la versión final para su publicación.

Correspondencia a Eszter Nagy.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Nagy, E., Homik, Z., Smausz, T. et al. Un análisis exhaustivo de las partículas de meloxicam producidas por ablación con láser de nanosegundos como técnica de molienda en húmedo. Informe científico 12, 12551 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16728-9

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Recibido: 14 Abril 2022

Aceptado: 14 julio 2022

Publicado: 22 julio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16728-9

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