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Sep 01, 2023

Análisis de proteína crítica

Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 350 (2023) Citar este artículo

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En los últimos años, la aparición del síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2), como causante de la pandemia mundial de la enfermedad por coronavirus (COVID-19), y sus variantes, especialmente aquellas con mayor transmisibilidad y evasión inmune sustancial, han destacado el imperativo de desarrollar nuevas terapias como soluciones sostenibles distintas de la vacunación para combatir los coronavirus (CoV). Además del reconocimiento del receptor y la entrada del virus, los miembros del complejo de replicación/transcripción del SARS-CoV-2 son objetivos prometedores para el diseño de antivirales. Aquí, los residuos que interactúan que median las interacciones proteína-proteína (PPI) de nsp10 con nsp16 y nsp14 se analizaron exhaustivamente, y se investigaron los mapas de interacción, las energías de interacción, las redes estructurales y la dinámica de los residuos clave. Nsp10 estimula tanto la exoribonucleasa (ExoN) de nsp14 como la 2'O-metiltransferasa (2'O-MTasa) de nsp16. Nsp14 ExoN es una enzima correctora de ARN que respalda la fidelidad de la replicación. Nsp16 2′O-MTase es responsable de completar la protección del ARN para garantizar una replicación y traducción eficientes y escapar del sistema inmunitario innato de la célula huésped. Los resultados del análisis de los PPI propusieron información crucial con implicaciones para el diseño de medicamentos antivirales contra el SARS-CoV-2. Sobre la base de las interfaces proteína-proteína compartidas predichas de las interacciones nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10, se diseñó un conjunto de inhibidores peptídicos de diana dual. Los péptidos diseñados se evaluaron mediante acoplamiento molecular, análisis de interacción péptido-proteína y cálculos de energía libre, y luego se optimizaron aún más mediante mutagénesis de saturación in silico. Sobre la base de la conservación evolutiva predicha de los residuos objetivo interactuados entre los CoV, los péptidos diseñados tienen el potencial de desarrollarse como inhibidores de pan-coronavirus de doble objetivo.

La nueva enfermedad por coronavirus humano 2019 (COVID-19), como consecuencia de la infección por el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1, ha provocado un gran número de muertes confirmadas en todo el mundo y una crisis económica global en años recientes. El SARS-CoV-2 es un betacoronavirus esférico envuelto que pertenece a la familia de virus de ARN Coronaviridae2. El genoma del SARS-CoV-2 comparte una identidad de secuencia del 96,2 %, 79 % y 50 % con el coronavirus de murciélago, el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV), respectivamente. La aparición del SARS-CoV-2 y luego sus variantes, en particular las variantes preocupantes (COV), junto con las emergencias anteriores del SARS-CoV en 2002-2003 con 8096 casos y 774 muertes (~ 10 % de tasa de mortalidad) y MERS -CoV en 2012 con 1728 casos confirmados y 624 muertes (~ 36% de tasa de mortalidad)3 demostró que los coronavirus (CoV) han sido durante mucho tiempo una gran amenaza para los humanos. También se debe considerar la patogenicidad de otros CoV humanos que causan el resfriado común, particularmente en bebés y niños4. La entrada acelerada de SARS-CoV-2 en la célula huésped comparable a otros CoV5, y el advenimiento de la variante Omicron (B.1.1.529) con mayor transmisibilidad (3,2 veces mayor que Delta) y evasión inmune sustancial6, así como su reciente sublinajes emergentes, como BA.4 y BA.5, la eficacia de las vacunas existentes se ha visto disminuida, lo que promueve reinfecciones y evasión de vacunas7. Por lo tanto, las vacunas y terapias iniciales contra el COVID-19 no podrían ser soluciones prolongadas. Por lo tanto, además de desarrollar tecnologías de diagnóstico y vigilancia para el SARS-CoV-28,9,10, es imperativo desarrollar nuevas terapias para combatir los CoV como soluciones sostenibles.

Los marcos de lectura abiertos (ORF) 1a/b son los ORF más grandes del genoma del SARS-CoV-2. Estos ORF están ubicados en el extremo 5 'del genoma y codifican dos precursores de poliproteína replicasa muy grandes, pp1a y pp1ab, que las proteasas virales escinden después de la traducción en 16 proteínas no estructurales (nsps) 11 (Fig. S1). Nsp12, nsp13, nsp16, nsp14, nsp10, nsp7 y nsp8 son miembros esenciales del complejo de replicación y transcripción (RTC) del SARS-CoV-2, que es responsable de la supervivencia, evolución y propagación viral. RTC promueve la replicación, la transcripción, la revisión y la protección del ARN a través del ensamblaje complejo de interacciones de ARN nsp-nsp y nsp-viral11,12,13,14.

Un proceso cotranscripcional conservado evolutivamente en el núcleo de todas las células eucariotas asegura la modificación del extremo 5' de los ARNm nacientes con un capuchón. La tapa del ARNm funciona como un grupo molecular conservante contra la escisión por exonucleasa, estabiliza las moléculas de ARN, asegura un transporte nucleocitoplasmático eficiente, una traducción proteica dependiente de la tapa vigorosa y un procesamiento previo al ARNm, y también evita la distinción del ARN no propio en la respuesta inmunitaria innata15,16 . La protección de los ARN ha sido secuestrada por virus para superar las respuestas del sistema inmunitario del huésped a través de diversos mecanismos. Los miembros de Coronaviridae han desarrollado su propio proceso de protección específico17. El mecanismo de limitación del SARS-CoV-2 consta de cuatro pasos ejecutados por una serie de nsp, incluido nsp13 como ARN 5′ trifosfatasa (RTPasa), una guanililtransferasa (GTasa) desconocida, el terminal C de nsp14 para N7-guanina-metiltransferasa (N7-MTasa) y nsp16 y su cofactor crítico nsp10 para la actividad de 2'O-metiltransferasa (2'O-MTasa)12,18,19 (Fig. 1b).

Representación esquemática del complejo de replicación y transcripción (RTC) de SAR-CoV-2 y su proceso de protección de ARNm. (a) Los miembros principales del RTC del SARS-CoV-2 incluyen ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp; nsp12), una proteína multifuncional con actividades helicasa y ARN 5′ trifosfatasa (Hel-RTPasa; nsp13), enzimas metiltransferasa (MTasa; ​​nsp16 y el C-terminal de nsp14), exoribonucleasa (ExoN; el N-terminal de nsp14) y nsp10 como un activador crítico para activar tanto nsp14 ExoN como nsp16 MTase. (b) Los pasos del proceso de protección del ARNm del SARS-CoV-2: primero, el enlace de interfosfato en el extremo 5 'del ARN trifosforilado naciente (pppN) es hidrolizado por nsp13 como RTPasa, formando el extremo de transcripción difosfato 5'-ppN. En segundo lugar, el trifosfato de guanosina (GTP) se escinde en monofosfato de guanosina (GMP) mediante una guanililtransferasa (GTasa) desconocida y se transfiere a ARNm de 5′-difosfato para producir GpppN. En tercer lugar, la estructura cap-0 (7mGpppN) está formada por nsp14 N7-guanina-metiltransferasa (N7-MTasa) en presencia de S-adenosilmetionina (SAM). Por último, la estructura cap-1 es producida por el complejo nsp16-nsp10 con actividad 2'O-metiltransferasa (2'O-MTasa).

El estudio de los miembros de RTC y, en particular, las interacciones proteína-proteína (PPI) de nsps puede ser un medio productivo para diseñar inhibidores de interferencia prometedores para CoV, especialmente después de la entrada viral en las células huésped. El papel vital de los IBP en casi todos los procesos biológicos los hace cada vez más atractivos para los enfoques terapéuticos20. Recientemente, los péptidos de interferencia (PI) se han reconocido con más frecuencia21, y algunos péptidos terapéuticos que se dirigen a los PPI han sido aprobados por la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. (FDA)22. Varios estudios han demostrado la potencia de los péptidos derivados para inhibir los IBP en los CoV23,24,25,26,27. Además, los datos clínicos y los enfoques computacionales han propuesto vacunas contra el SARS-CoV-2 nsps como péptidos inmunodominantes con capacidad para conferir inmunidad global frente al COVID-1928.

Recientemente hemos investigado el patrón de unión proteína-proteína de la entrada del SARS-CoV-229. El objetivo general del estudio actual fue arrojar luz sobre las interacciones de nsp10, como un activador común con nsp16 que cubre MTase y nsp14 ExoN en el RTC de SARS-CoV-2, y luego diseñar inhibidores de péptidos para atacar estos IBP críticos (Fig. .S2). Inicialmente, los residuos de interacción críticos involucrados en estos PPI se investigaron y luego se analizaron desde las perspectivas de descomposición de energía libre, mapas y energías de interacción, redes estructurales y dinámica molecular (Fig. S3). Estos análisis integrales brindan una imagen completa de los residuos críticos que son de suma importancia para mediar en los mecanismos de protección y corrección en el SARS-CoV-2. Estos residuos clave sirven como residuos farmacológicos, con implicaciones para el diseño de fármacos SARS-CoV-2. A continuación, de acuerdo con los resultados obtenidos, se diseñó un conjunto de péptidos inhibidores de doble diana en función de las interfaces proteína-proteína compartidas predichas de las interacciones nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10. Por lo tanto, estos péptidos abren una ruta novedosa para perturbar simultáneamente las maquinarias de corrección y protección del ARN del SARS-CoV-2, con el potencial de inhibir el escape viral del reconocimiento inmunológico del huésped, aumentar la tasa de mutación y, en consecuencia, provocar efectos letales en el SARS- CoV-2. La conservación evolutiva prevista en el amplio espectro de CoV para los residuos objetivo que interactuaron con los péptidos diseñados indica la gran potencia de los péptidos diseñados para desarrollarse como nuevos antivirales pan-coronavirus para posibles brotes actuales o futuros relacionados con CoV.

Se utilizó el Protein Data Bank (rcsb.org/)30 para obtener las estructuras complejas nsp16-nsp10 de SARS-CoV-2 (PDB ID 6W75)31, SARS-CoV (PDB ID 2XYQ)32, MERS-CoV (PDB ID 5YNB) y HCoV-OC43 (ID de PDB 7NH7)33. La estructura del complejo SARS-CoV-2 nsp14-nsp10 se modeló seleccionando el complejo SARS-CoV nsp14-nsp10 (PDB ID 5C8S)14 como plantilla utilizando SWISS-MODEL34.

Los residuos en las interfaces de los complejos proteína-proteína investigados se predijeron utilizando tres herramientas in silico, incluido PPCheck 35, el servicio PISA (Protein Interfaces, Surfaces and Assemblies) del Instituto Europeo de Bioinformática (http://www.ebi.ac uk/pdbe/prot_int/pistart.html)36 e ISPRED437. A continuación, se predijeron los residuos del punto de acceso utilizando KFC2 (FADE y contactos basados ​​en el conocimiento)38, DrugScorePPI39 y Robetta40. Para mejorar la precisión de los resultados, se utilizó una combinación de herramientas para identificar las interfaces proteína-proteína y los puntos críticos. Un residuo se consideró residuo clave (interfaz y/o punto de acceso) si estaba presente al menos en los resultados de dos de las tres herramientas. Además, para el análisis comparativo, la interfaz de PPI y los residuos del punto de acceso del complejo nsp16-nsp10 de SARS-CoV, MERS-CoV y HCoV-OC43 también se predijeron según el enfoque anterior. Los residuos clave fueron asignados a las estructuras de las proteínas por UCSF Chimera41. El gráfico de estructura secundaria para ambos complejos se predijo utilizando PDBsum42. A continuación, mCSM-PPI2 (http://biosig.unimelb.edu.au/mcsm_ppi2) realizó el escaneo computacional de alanina (CAS) de los residuos de interacción clave predichos de los complejos SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10. /), y el impacto de cada mutación se evaluó mediante la predicción de la diferencia en las afinidades de unión proteína-proteína entre el tipo salvaje y el mutante, que se define como ΔΔGAffinity (ΔΔG = ΔGMutant − ΔGwild-type)43. Además, se analizaron las interacciones entre los residuos de tipo salvaje y mutantes con la afinidad ΔΔGA más negativa y sus residuos cercanos. Luego, el servidor HawkDock (cadd.zju.edu.cn/hawkdock)44 realizó un análisis de descomposición de energía libre por residuo mediante cálculos de Mecánica Molecular-Área Nacida Generalizada (MM-GBSA) para el SARS-CoV-2 nsp16- complejos nsp10 y nsp14-nsp10.

Las interacciones de los residuos se analizaron y mostraron en mapas 2D empleando DIMPLOT de Ligplot+45. Además, se utilizó el servidor Protein Interactions Calculator (PIC) (pic.mbu.iisc.ernet.in)46 para analizar diferentes tipos de interacciones. Además, se utilizó COCOMAPS (molnac.unisa.it/BioTools/cocomaps)47 para analizar las interfaces de PPI investigadas a una distancia de corte de 8 Å proporcionando los mapas de contacto de propiedad y distancia. Además, las superficies accesibles de los complejos fueron predichas por COCOMAPS. Además, las energías de interacción (IE) entre residuos fueron predichas por el servidor web Amino Acid Interactions (INTAA) (bioinfo.uochb.cas.cz/INTAA/)48 con la ayuda del campo de fuerza AMBER parm99, similar al agua (OBC -II) medio ambiente, y el modo añadir hidrógeno. Los mapas de calor se generaron utilizando THE Heatmapper49. Todo el procedimiento se realizó para los complejos SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10.

El servidor Network Analysis of Protein Structures (NAPS) (bioinf.iiit.ac.in/NAPS/index.php)50 se utilizó para el análisis de red estructural de los complejos SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10. Los parámetros de centralidad del nodo, incluidos el grado de centralidad (DC), la centralidad de intermediación (BC) y la centralidad de cercanía (CC) de los residuos en la red, se predijeron seleccionando el tipo de red no ponderada C-alfa con un umbral superior de 7 Å en el modo complejo proteico de NAPS.

Las simulaciones de dinámica molecular (MD) de los complejos nsp14-nsp10, nsp16-nsp10, así como las proteínas nsp14, nsp16 y nsp10 fueron realizadas por el paquete AMBER1451 utilizando el campo de fuerza ff14SB52. Los sistemas se solvataron mediante el modelo TIP3P de agua explícito en una caja octaédrica truncada en una capa de hidratación de 12 Å usando xleap. Se agregaron cinco iones de cloruro para neutralizar los sistemas. Todos los enlaces covalentes de los átomos de hidrógeno se agregaron a los sistemas utilizando el algoritmo SHAKE53. Las interacciones electrostáticas se calcularon utilizando el algoritmo PME (Particle Mesh Ewald)54 con un umbral de 10 Å para las interacciones potenciales de Lennard-Jones en condiciones de contorno periódicas. El paso de minimización se realizó para eliminar los contactos de alta energía utilizando 2000 pasos del método de descenso más pronunciado y 3000 pasos del método de gradiente conjugado, respectivamente. Luego, cada sistema se calentó completamente de 0 a 300 K durante 400 ps en un volumen constante. El equilibrio de los sistemas se realizó en condiciones de presión y temperatura constantes durante 1 ns. Después del equilibrio, las simulaciones se realizaron utilizando pmemd durante un período de 100 ns. Se utilizó el algoritmo de Langevin55 para controlar la temperatura dentro de las simulaciones. Finalmente, las trayectorias se analizaron utilizando cpptraj56. XMGRACE57 se utilizó para generar gráficos de desviación cuadrática media (RMSD) y fluctuación cuadrática media (RMSF).

En este estudio, los péptidos inhibidores se diseñaron en base a dos metodologías. En el primer enfoque, los péptidos inhibitorios se diseñaron manualmente en función de los residuos de interacción superpuestos previstos de nsp10, que interactúan tanto con nsp16 como con nsp14 en el SARS-CoV-2. En el segundo enfoque, los PPI en las interfaces de los complejos SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10 se analizaron individualmente usando el servidor Peptiderive58 para diseñar inhibidores de péptidos para apuntar a nsp16/nsp14. Peptiderive separó sistemáticamente los péptidos de nsp10 con una ventana deslizante (con 5 a 15 longitudes en cada etapa de predicción) y luego evaluó las contribuciones de estos péptidos aislados a la interacción general.

En el primer paso, se realizó el acoplamiento molecular utilizando el servidor HPEPDOCK (http://huanglab.phys.hust.edu.cn/hpepdock/)59 para el acoplamiento local de los péptidos diseñados con sus respectivos objetivos. Los residuos del sitio de unión del objetivo se especificaron como una referencia basada en los residuos de interacción clave predichos del objetivo. Los mejores criterios de selección de modelos de los 10 mejores modelos pronosticados para cada complejo péptido-objetivo fueron los siguientes: (i) el modelo que se unió a los residuos clave del objetivo con una pose similar en relación con la interacción de referencia e interactuó con más residuos clave del objetivo; (ii) el modelo con RMSD relativamente bajo entre todos los modelos pronosticados, que se examinó superponiéndolo con la estructura de referencia; y (iii) el modelo con la puntuación de energía de acoplamiento más baja. Cada modelo del complejo péptido-proteína se analizó utilizando DIMPLOT45 y UCSF Chimera41. Según los resultados de HPEPDOCK, los mejores péptidos se sometieron a más análisis de acoplamiento. Luego, las estructuras 3D de los péptidos seleccionados se modelaron usando MODPEP (http://huanglab.phys.hust.edu.cn/modpep/)60. Se eligió el mejor modelo, y este paso fue seguido por el acoplamiento de péptido-proteína utilizando HADDOCK 2.461. Los residuos de interacción clave predichos de los pasos anteriores se especificaron como residuos activos, que estaban directamente involucrados en la interacción péptido-proteína, y todos los residuos de la superficie circundante dentro del radio de 6,5 Å alrededor de los residuos activos se definieron como residuos pasivos. Cabe destacar que el dominio ExoN de nsp14 se utilizó para el acoplamiento molecular. Aquí, se utilizaron los mismos criterios de selección del mejor modelo que en el paso anterior. La energía libre de unión (ΔG) y la constante de disociación (Kd) del mejor complejo del objetivo de péptido diseñado obtenido mediante el segundo paso de acoplamiento se predijeron utilizando Prodigy (wenmr.science.uu.nl/prodigy)62. Además, los cálculos de MM-GBSA utilizando el campo de fuerza ff02, 2000 ciclos de descenso más pronunciado y 3000 ciclos de minimizaciones de gradiente conjugado en HawkDock (cadd.zju.edu.cn/hawkDock)44 se utilizaron para calcular las energías libres de unión de péptidos –complejos proteicos y descomponerlos en contribuciones por residuo.

Se usó el método MM-PBSA63 para estimar la energía libre de unión (ΔGbinding) de los péptidos diseñados con mejor puntuación a sus objetivos respectivos. Durante 50 ns, las simulaciones MD de los complejos de péptido-proteína de mejor puntuación se realizaron con AMBER1451. Luego, se tomaron 200 instantáneas de complejos de péptido-proteína de la trayectoria en varios pasos de tiempo para calcular los valores promedio de ΔGbinding por mmpbsa.py64.

Los péptidos diseñados con mejor puntuación se optimizaron mediante el análisis de mutagénesis de saturación in silico mediante la mutación de cada residuo de los péptidos diseñados como secuencias principales a los otros 19 aminoácidos para generar una nueva biblioteca de péptidos. Luego, el cambio en la afinidad de unión del nuevo objetivo peptídico mutante en relación con el complejo principal de péptido objetivo (ΔΔGAffinity) y el impacto de cada mutación en la afinidad de unión del péptido objetivo se predijeron utilizando mCSM-PPI243. Para evaluar más a fondo los péptidos diseñados, se calcularon sus propiedades generales, incluido el peso molecular, el punto isoeléctrico y la carga neta a pH 7, utilizando Pep-CaLc65. Además, las propiedades farmacocinéticas de los péptidos diseñados fueron predichas por pkCSM (http://biosig.unimelb.edu.au/pkcsm/)66. La mitad de la concentración inhibitoria máxima (IC50) de los péptidos diseñados fue predicha por AVP-IC50Pred (crdd.osdd.net/servers/ic50avp/) usando la técnica de aprendizaje automático Random Forest (RFs)67. La alergenicidad y la toxicidad de los péptidos fueron predichas por AllergenFP v.1.068 y ToxinPred69, respectivamente. Los complejos de proteína-péptido diana se simularon mediante CABS-flex 2.0 (biocomp.chem.uw.edu.pl/CABSflex2/index)70 con parámetros predeterminados para analizar las fluctuaciones de los residuos y generar gráficos RMSF.

Se realizaron múltiples alineaciones de secuencias de secuencias nsp10, nsp16 y nsp14 de siete CoV humanos, incluidos SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-HKU1, HCoV-NL63 y HCoV-229E. usando MultAlin71. Se usó ESPrip para renderizar las secuencias72. Para explorar los residuos conservados evolutivamente de las proteínas nsp10 y nsp16 en todas las estructuras informadas del complejo nsp16-nsp10, incluidos SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV y HCoV-OC43, el servidor web ConSurf (consurf .tau.ac.il/)73 se empleó en base al método bayesiano. Además, se analizó la conservación de aminoácidos del modelo de proteína SARS-CoV-2 nsp14.

En este estudio, primero, se predijeron los residuos clave en la interfaz de los complejos proteína-proteína que median los PPI. En la Fig. S3 se presenta una representación del flujo de trabajo de este estudio. La interfaz proteína-proteína predicha final y los residuos del punto de acceso de los complejos SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10 se enumeran en la Tabla 1. Los residuos de interacción clave pronosticados con cada herramienta se enumeran en las Tablas S1. Para el complejo nsp16-nsp10, se predijeron 33 residuos como residuos de interfaz nsp16 y 26 residuos como residuos interfaciales nsp10. V42, K43, M44, L45 e Y96 de nsp10 e I40, M41, V44, T48, V78, V84, Q87, V104 y D106 de nsp16 se predijeron como residuos de puntos críticos para el complejo nsp16-nsp10. Para el complejo nsp14-nsp10, se identificaron 106 residuos en la interfaz proteína-proteína, 45 y 61 residuos en las interfaces de nsp14 y nsp10, respectivamente. T5, E6, N10, S11, L14, S15, F16, F19, V21, N40, V42, M44, S72, R78, C79, H80, F89, K93 e Y96 se predijeron como puntos de acceso nsp10 en el complejo nsp14-nsp10 . Los residuos de interacción clave para ambos complejos se mapearon en sus estructuras (Fig. 2a, b). Además, las gráficas de estructura secundaria para los complejos SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10 se muestran en las figuras S4 y S5, respectivamente.

Análisis de las interfaces proteína-proteína del SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10 y residuos de puntos críticos. (a) Las interfaces y los puntos de acceso se asignaron a la estructura nsp16-nsp10 en las interfaces proteína-proteína de nsp16 (gris) y nsp10 (cian), que son de color naranja y rojo, respectivamente. (b) Las interfaces y puntos de acceso en las interfaces proteína-proteína de nsp14 (magenta) y nsp10 (cian) están coloreadas de amarillo y rojo, respectivamente. Los residuos de puntos calientes se muestran en etiquetas rojas. ( c ) La interfaz clave superpuesta (púrpura) y los residuos del punto de acceso (rojo) de nsp10 (cian), que interactuaron con las proteínas nsp16 y nsp14.

En particular, entre los residuos de interacción clave de nsp10, 24 residuos de interfaz y tres residuos de puntos de acceso se compartieron entre los dos complejos en SAR-CoV-2. Estos residuos clave de nsp10 interactuaron tanto con nsp16 (remate de 2'O-MTasa) como con nsp14 (revisión de ExoN). Los residuos de interfaz común superpuestos de nsp10 en estos dos complejos fueron T39, N40, C41, V42, K43, M44, L45, C46, ​​T47, V57, T58, P59, G69, G70, A71, S72, C77, R78, C79, H80, K93, G94, K95 e Y96. Los puntos de acceso comunes fueron V42, M44 e Y96 (Fig. 2c). Además, el análisis de los residuos interfaciales y de punto de acceso de PPI indicó las interacciones entre los residuos en el bucle N-terminal y la hélice H1 del dominio ExoN nsp10 y nsp14. Además, para dilucidar las similitudes y diferencias en las interacciones de nsp10 con nsp16 entre CoV, las interfaces proteína-proteína y los puntos críticos del complejo nsp16-nsp10 en SARS-CoV, MERS-CoV y HCoV-OC43 también se predijeron aplicando el mismo enfoque (Tabla S1). Los residuos, incluidos V42, K43, M44 y L45, fueron puntos críticos comunes de nsp10 en todos estos CoV. Las diferencias radicaron en T47, R78 e Y96 de nsp10 en SARS-CoV; K58, H80 y F96 de nsp10 en MERS-CoV; y N40, C41, C46, ​​D47, V57, K58, S72, C77, R78, H80, L89, C90, R93, K95 y F96 de nsp10 en HCoV-OC43. V84, Q87, V104 y D106 fueron los puntos de acceso compartidos de nsp16 entre estos CoV (Figs. S6–S8).

A continuación, CAS analizó los residuos de interacción clave previstos utilizando mCSM-PPI2. En total, se analizaron 153 mutaciones para predecir el impacto de la sustitución de alanina en la afinidad de unión proteína-proteína (Tabla S2). Como se muestra en la Fig. S9, las mutaciones, que incluyen respectivamente Y96A, L45A, V42A, M44A y G70A de nsp10; V84A, D106A, V44A, I40A y R86A de nsp16 en el complejo nsp16-nsp10; F16A, Y96A, H80A, E6A y F19A de nsp10 y F8A, P24A, F60A, Q22A y D10A de nsp14 en el complejo nsp14-nsp10; mostró la ΔΔGAffinity más negativa, con los mayores impactos decrecientes en las afinidades de unión nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10. Estos resultados revelaron el papel fundamental de estos residuos en la mediación de los PPI. Todos estos residuos, excepto G70 de nsp10, R86 de nsp16 y P24 de nsp14, se predijeron como puntos críticos en el paso anterior. Sin embargo, las mutaciones, incluidas T49A, V57A y C79A de nsp10 y T91A, G92A y S248A de nsp16 en el complejo nsp16-nsp10, P8A, S33A, V57A y C79A de nsp10 y T21A, C39A y K47A de nsp14 en el complejo nsp14-nsp10, mostró pequeños valores positivos de ΔΔGAffinity (< 1,3 kcal/mol), lo que indica la menor importancia de dichos residuos para la formación del complejo. Las interacciones entre los residuos de tipo salvaje y mutantes con la afinidad ΔΔGA más negativa y sus residuos cercanos se muestran en las Figs. S10-S13. Además, los resultados del análisis de descomposición de energía libre por residuo utilizando el método MM-GBSA para los complejos nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10 se muestran en la Tabla S3. Estos resultados indicaron que los residuos de interacción clave contribuyeron significativamente a que los PPI se unieran a la energía libre en comparación con otros residuos. Las energías libres de unión estimadas más bajas de L45, V42 y M44 de nsp10, y Q87, I40 y V104 de nsp16 en el complejo nsp16-nsp10; y F19, V21 y H80 de nsp10, y N130, H26 e I201 de nsp14 en el complejo nsp14-nsp10 indicaron sus mayores contribuciones en estos dos PPI, respectivamente. Los resultados de MM-GBSA fueron consistentes con la predicción del punto crítico y los resultados de CAS; sin embargo, el N130 de nsp14 no se predijo como punto de acceso en el paso anterior.

Según el análisis de los mapas 2D de las interacciones residuo-residuo en el complejo SARS-CoV-2 nsp16-nsp10, las interacciones hidrofóbicas fueron las interacciones más abundantes (Fig. S14a). N40, V42, K43, M44, L45, P59, A71, K93 e Y96 de nsp10 contribuyeron a varias interacciones hidrofóbicas con los residuos de nsp16. Además, K43, L45, A71, K93, G94 e Y96 de nsp10 formaron enlaces H con los residuos de nsp16. A71 y G94 de nsp10 participaron en enlaces H con D106 de nsp16. Además, K43, L45, K93 e Y96 de nsp10 formaron enlaces H con K38, Q87, S105 y A83 de nsp16, respectivamente. El análisis de la interacción nsp16-nsp10 por PIC generó los mismos resultados que DIMPLOT (Tabla S4), lo que indica que las interacciones hidrofóbicas eran predominantes. Además, el análisis PIC mostró que E66 y H80 de nsp10 formaron interacciones iónicas con K38 y D102 de nsp16, respectivamente. Además, para realizar un análisis comparativo, se generaron gráficos de mapas 2D de interacciones de residuos para el complejo nsp16-nsp10 en otros CoV (SARS-CoV, MERS-CoV y HCoV-OC43), y los resultados se representan en las Figs. S15–S17.

Según los resultados de DIMPLOT para el complejo SARS-CoV-2 nsp14-nsp10 (Fig. S14b), las interacciones de los residuos fueron predominantemente hidrofóbicas en las interfaces proteína-proteína, similar a lo que se observó para el complejo nsp16-nsp10. El análisis de enlaces H reveló que K43 y L45 de nsp10 formaron enlaces H con el C39 de nsp14. Se encontraron otros enlaces H entre T5, E6 y S15 de nsp10 y S28, T5 y F60 de nsp14, respectivamente. K93 de nsp10 contribuyó a las interacciones con D126 y T127 de nsp14 a través de dos enlaces H. Además, se formaron enlaces H entre N40, G94 e Y96 de nsp10 y H29, K47 y D41 de nsp14, respectivamente. De manera similar, los resultados de DIMPLOT y PIC estuvieron en la misma línea para el complejo nsp14-nsp10. Además, PIC predijo otros tipos diferentes de interacciones, es decir, iónico, aromático-azufre, aromático-aromático y catión-pi para el complejo nsp14-nsp10 (Tabla S4). Las diferencias en las interacciones de SARS-CoV-2 nsp10 con nsp16 y nsp14 radican principalmente en las interacciones de los residuos en el terminal N de nsp10 con nsp14, las interacciones como enlaces H entre A1, A18, F19, V21 y D29 de nsp10 y K9, K196, I201, I201 e Y69 de nsp14, respectivamente. Además, N3 de nsp10 formó dos enlaces H con D10 de nsp14.

Los contactos intermoleculares con una distancia de corte de 8 Å se analizaron utilizando COCOMAPS para representar las regiones nsp16/nsp14 que están en contacto con el SARS-CoV-2 nsp10. En los mapas de contacto de rango de distancia (Fig. S18a), los contactos intermoleculares de ambos complejos están coloreados según aumenta la distancia. Los pares de residuos de nsp10 y nsp16, incluidos Y96-A83, K43-K38, K93-S105, L45-Q87 y G94-D106, exhibieron una distancia mínima de < 2,82 Å. Además, los pares de residuos, incluidos F60-S15, K9-A1 e Y69-D29 de nsp14 y nsp10, se observaron en el complejo nsp14-nsp10 con una distancia mínima de < 2,64 Å. El mapa de contactos del complejo nsp14-nsp10 puede indicar el papel de los residuos que interactúan con nsp10 en la activación de la ExoN de nsp14 en el N-terminal. No se observó contacto intermolecular entre nsp10 y el terminal C de nsp14. La naturaleza fisicoquímica de las interacciones se indica mediante los mapas de contacto de propiedades (Fig. S18b). Como se aclara en los mapas de propiedades, las interacciones hidrofóbicas contribuyeron más que las interacciones hidrofílicas para ambos complejos. Estos resultados estaban en buen acuerdo con los resultados de DIMPLOT y PIC. Además, COCOMAPS mostró que una gran área de aproximadamente 1852,3 Å2 quedó enterrada tras la formación del complejo SARS-CoV-2 nsp16-nsp10, y su gran área de interfaz fue de aproximadamente 926,75 Å2. De manera similar, el área enterrada y el área de interfaz del SARS-CoV-2 nsp14-nsp10 tras la formación del complejo eran grandes, midiendo 4358,47 y 2180,15 Å2, respectivamente.

A continuación, se analizaron las energías de interacción residuo-residuo (IE) de los complejos SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10 utilizando INTAA. De acuerdo con los resultados, D106 de nsp10 y D125 de nsp16 mostraron los IE netos más negativos (−190,6 y −518,33 kJ/mol, respectivamente). Entre los residuos de interacción clave predichos, E66, Y96 y S72 de nsp10, así como D106, D108 y S105 de nsp16 mostraron los IE netos más negativos. La Figura S19 muestra un mapa de calor para los IE por pares de residuos entre los residuos de interacción clave predichos de nsp10 y nsp16. Los IE por pares más negativos con funciones estabilizadoras en los PPI incluyeron las interacciones entre K93 y D106, K93 y S105, A71 y D106, G94 y D106 de nsp10 y nsp16, respectivamente. Como se mencionó anteriormente, las distancias del par de residuos, incluidos K93 y S105, así como G94 y D106, se predijeron entre las distancias mínimas en el paso anterior por COCOMAPS. El análisis de IE del complejo nsp14-nsp10 reveló que E6 de nsp10 y E284 de nsp14 mostraron los IE netos más negativos (-504,75 y -296,05 kJ/mol, respectivamente). E6, D29, K25 y D22 de nsp10 y D10, D126, E2 y F60 de nsp14 mostraron los IE netos más negativos entre los residuos de interacción clave previstos en el complejo nsp14-nsp10. Las interacciones entre D29 e Y69, S15 y F60, F19 y K200, E6 y V4 de nsp10 y nsp14, respectivamente, fueron los IE por pares más estabilizadores (Fig. S20). Todos estos residuos con las funciones más estabilizadoras en los PPI se predijeron como los residuos de interacción clave en los pasos anteriores.

Se realizaron análisis de la red de contacto de proteínas (PCN) de los complejos SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10 para determinar la importancia topológica de cada residuo como un nodo en la red proteína-proteína. Los parámetros de centralidad del nodo de los residuos, incluido el grado de centralidad (DC), la centralidad de intermediación (BC) y la centralidad de cercanía (CC) de los residuos en la red, se predijeron para ambos complejos (Tabla S5). En el complejo nsp16-nsp10, G69, G70, Y96, A71 y K95 de nsp10 y V44, A45, V84 y D106 de nsp16 mostraron la DC más alta entre los residuos clave predichos. Los resultados revelaron que G69, M44, G70, G94 y K95 de nsp10 y V44, D106, D108, T91 e I40 de nsp16 mostraron la BC más alta entre los residuos críticos de PPI. Se predijeron valores altos de CC de los residuos clave para M44, G69, V57, K43 y G94 de nsp10, y V44, D106, V84 y A107 de nsp16 (Fig. S21). El análisis PCN de los residuos de interacción clave pronosticados de la interacción nsp14-nsp10 mostró que, entre los residuos de interacción críticos, G70, Y96, A71, K95 y A20 de nsp10, y K9, D10, I55 y T131 de nsp14 mostraron una DC alta. En particular, también se predijo que G70, A71, K95 e Y96 tendrían un DC alto en el complejo nsp16-nsp10, lo que indica que estas redes eran comunes en ambos complejos. Además, F19, S15, A20, A18 y V21 de nsp10 y G59, F60 e Y69 de nsp14 mostraron la CC más alta entre los residuos clave. Se predijeron valores altos de BC de los residuos clave para T5, A18, C79, A20 y F19 de nsp10, y G6, T25, G59, Y69 y F60 de nsp14 (Fig. S22). Las redes 3D de los complejos nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10 y sus interfaces resaltadas se muestran en la Fig. S23.

Para investigar la estabilidad, las fluctuaciones de los residuos y el comportamiento dinámico de las proteínas, se analizaron simulaciones MD de 100 ns de los componentes de protección y corrección del SARS-CoV-2. Los RMSD de los backbones, como uno de los criterios de estabilidad estructural durante las simulaciones, se calcularon en comparación con la estructura de referencia. Como se indica en la Fig. 3a, los RMSD de las estructuras tuvieron un aumento inicial, aumentaron durante los primeros 45 ns y luego se mantuvieron estables. Estos resultados indicaron que los cambios conformacionales fueron menores y que la unión de nsp14 y nsp10 fue estable. Nsp14 tenía valores RMSD mayores que nsp10, lo que indica que era más flexible en la forma libre. Para analizar las fluctuaciones de los residuos, se calcularon los RMSF de los átomos de Cα. Se observaron valores más altos de RMSF en nsp10 principalmente en el bucle N-terminal (A1-V7), la hélice H1 (S11-F19) y en la región de la bobina y la hebra (V42-T47) (Fig. 3b). Las fluctuaciones más altas de la hélice H1 en nsp10 pueden considerarse como una indicación de su papel en la activación de nsp14 ExoN. En la estructura de nsp14, las regiones que median las interacciones con nsp10 mostraron más fluctuaciones que se ubicaron en el dominio N-terminal de la proteína. Las simulaciones MD mostraron que dos dominios particulares de nsp14 estaban conectados a través de una región bisagra. Esta región bisagra puede separar la actividad ExoN y N7-MTas de nsp14. Los RMSD de la columna vertebral se calcularon con respecto a la estructura de referencia para el complejo nsp16-nsp10, así como las formas libres de las proteínas nsp16 y nsp10 (Fig. 3a). Los valores de RMSD fueron relativamente estables después de 30 ns. Los valores promedio de RMSD para nsp16-nsp10, nsp16 y nsp10 fueron 3,6, 2,4 y 2,05 Å, respectivamente. A continuación, se calcularon los valores de RMSF para las proteínas del complejo nsp16-nsp10, nsp16 y nsp10 (Fig. 3b).

Gráficos RMSD y RMSF para los complejos SARS-CoV-2 nsp14-nsp10 y nsp16-nsp10 durante 100 ns de simulaciones MD. (a) Gráfico RMSD para nsp14-nsp10, nsp14, nsp10, nsp16-nsp10 y nsp16, y (b) Gráficos RMSF para nsp10, nsp14, nsp14-nsp10, nsp16 y nsp16-nsp10.

Los resultados del análisis de los PPI establecen un contexto apropiado para el diseño de fármacos. Los resultados de los análisis antes mencionados nos impulsaron a diseñar inhibidores de péptidos dirigiéndonos a las interacciones investigadas para interrumpir los mecanismos de protección y corrección del SARS-CoV-2. Con este fin, en un enfoque inicial, dadas las interfaces proteína-proteína compartidas previstas de las interacciones nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10 (Fig. 2c), los péptidos inhibidores dirigidos tanto al SARS-CoV-2 nsp16 2′O-MTasa y nsp14 ExoN se diseñaron manualmente. Se diseñó un conjunto de inhibidores de péptidos de diana dual (19 péptidos), en lo sucesivo denominados péptidos superpuestos (OLP) con longitudes que oscilan entre 4 y 8 (Tabla S6), en función de los residuos de interacción clave superpuestos previstos de nsp10 en SAR-CoV- 2, es decir, T39-T47, G69-S72, C77-H80 y K93-Y96. Mientras tanto, en un enfoque paralelo, se predijeron individualmente cuatro conjuntos de péptidos como segmentos calientes con las energías de unión significativas para cada complejo utilizando el servidor Peptiderive. En total, 22 lineales (P-16-5 a P-16-15 y P-14-5 a P-14-15) (Tabla S7) y 16 péptidos cíclicos (Tabla S8) con las puntuaciones de interfaz relativas más altas (porcentaje ) fueron diseñados. Es notable que la comparación de los péptidos diseñados por las dos metodologías reveló cinco secuencias peptídicas similares. Los OLP, incluidos OLP-11, OLP-13, OLP-16, OLP-18 y OLP-19, y los péptidos diseñados por Peptiderive para dirigirse a nsp16, incluidos P-16-5, P-16-6, P- 16-7, P-16-8 y P-16-9 tienen las mismas secuencias. Es importante destacar que solo los péptidos lineales se consideraron en este estudio y se evaluaron más. Para evaluar los péptidos cíclicos predichos se requiere otro estudio de investigación.

El acoplamiento molecular se utilizó para investigar las poses y energías de unión de los péptidos inhibidores diseñados con la proteína diana. El procedimiento de acoplamiento incluía dos pasos. En el primer paso, HPEPDOCK realizó el acoplamiento de péptido-proteína utilizando su algoritmo de acoplamiento local y especificando los residuos de interacción clave del objetivo. Según los mejores criterios de selección del modelo, las puntuaciones de energía de acoplamiento de los 36 péptidos diseñados oscilaron entre -152,081 y -49,141, y entre -226,821 y -67,438 para el acoplamiento con nsp16 y nsp14, respectivamente (Tablas S6 y S7). Entre los OLP, OLP-13 cuando el objetivo era nsp16 y OLP-18 cuando el objetivo era nsp14 mostraron las puntuaciones de energía de acoplamiento más bajas (-148,518 y -135,334, respectivamente). Se seleccionaron los OLP con los puntajes de energía de acoplamiento más bajos para ambos objetivos. Para el segundo paso de acoplamiento, 14 de los 36 péptidos diseñados con las puntuaciones de energía de acoplamiento más negativas, incluidos OLP-13, OLP-16, OLP-17, OLP-18, P-16-11, P-16-12, P-16-13, P-16-14, P-16-15, P-14-11, P-14-12, P-14-13, P-14-14 y P-14-15 fueron seleccionados .

Los resultados del acoplamiento péptido-proteína por HADDOCK, incluida la puntuación HADDOCK, RMSD de la estructura general de energía más baja, energía de Van der Waals, energía electrostática, energía de desolvatación y área de superficie enterrada para cada complejo péptido-objetivo, se informan en Tabla S9. Todos los péptidos estudiados interactuaron con nsp16 en casi las mismas poses con las que interactuó nsp10. Entre las interacciones OLPs-nsp16, OLP-18 y OLP-13 mostraron las puntuaciones más bajas de HADDOCK de − 65,8 ± 4,6 y − 50 ± 2,1 con las grandes áreas de superficie enterrada de 1213,3 ± 29,8 y 950 ± 16,9 Å2, respectivamente. P-16-11 y P-16-13 mostraron las puntuaciones más negativas de HADDOCK entre los péptidos diseñados específicamente para dirigirse a nsp16. Entre las interacciones OLPs-nsp14, OLP-18 y OLP-13 mostraron las puntuaciones más bajas de HADDOCK (−41,1 ± 1,9 y −39,1 ± 11,3, respectivamente). Se predijeron la puntuación más baja de HADDOCK (-99,4 ± 2,5) y la mayor superficie enterrada (1918,3 ± 24,4 Å2) para el complejo P-14-15-nsp14. Las puntuaciones de HADDOCK del acoplamiento de nsp10 con nsp16 y nsp14 se predijeron como referencia (−117,1 ± 2 y -123,4 ± 3, respectivamente).

En el siguiente paso, se calcularon ΔG y Kd del mejor modelo de complejo péptido-objetivo para cada péptido (Tabla S9). El ΔG de cada complejo se comparó con el ΔG de la estructura de referencia. Los valores previstos de ΔG y Kd para el SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 fueron -12,8 kcal/mol y 4,3 × 10-10 M, respectivamente. Entre los péptidos diseñados para atacar nsp16, P-16-15, P-16-14, P-16-12, OLP-18 y P-16-13, respectivamente, mostraron los valores de ΔG más bajos (el más negativo, el más bajo). mejor afinidad). Los valores predichos de ΔG y Kd para nsp14 fueron −21,6 kcal/mol y 1,4 × 10−16 M, respectivamente. Los péptidos diseñados para dirigirse a nsp14, es decir, P-14-15, P-14-14, P-14-13, P-14-12 y P-14-11, respectivamente, mostraron los valores de ΔG más negativos. Los valores de ΔG de OLP-13 y OLP-18 para interacciones con nsp14 fueron los mismos (-8,9 kcal/mol). Los péptidos diseñados con valores de Kd más bajos tenían el potencial de unirse más fuertemente a su proteína diana respectiva. Además, la Tabla S9 muestra los resultados del análisis de descomposición de energía libre de MM-GBSA de los complejos péptido-objetivo. Péptidos inhibidores de nsp16, incluidos OLP-18, P-16-12 y P-16-13, así como inhibidores peptídicos de nsp14, incluidos P-14-15, P-14-14 y P-14-12 , mostraron las energías libres MM-GBSA más negativas, respectivamente. La contribución de energía de los péptidos diseñados por residuo se enumera en la Tabla S9. La menor energía de unión de un residuo indica su papel fundamental en la interacción péptido-objetivo. En OLP-13-nsp16, OLP-13-nsp14, OLP-18-nsp16 y OLP-16-nsp14, la metionina en la posición 5 mostró la energía más baja en relación con otros residuos de los péptidos. Además, los 10 residuos principales de las proteínas objetivo con las energías más bajas se informan en la Tabla S9, y los 5 principales se muestran en las Figs. S24–S27. En las interacciones OLPs-nsp16, I40, M247, V44 y A83 fueron los residuos comunes de nsp16 con las contribuciones de energía más bajas y, en consecuencia, los roles más críticos. T25, P24 y F8 de nsp14 fueron residuos críticos comunes (con las energías más bajas) en todas las interacciones OLP-nsp14 (Tabla S9). La Tabla 2 resume los péptidos inhibidores diseñados, sus puntajes de acoplamiento previstos y energías de unión.

Después de los análisis de energía de acoplamiento y unión de los péptidos diseñados, se analizaron las interacciones de los péptidos diseñados en la Tabla 2 con la proteína objetivo para obtener una mejor comprensión de los residuos clave que interactúan y sus tipos de interacción. Los residuos de la proteína objetivo en la interfaz involucrada en cada interacción péptido-objetivo se enumeran en la Tabla S9. Los residuos de nsp16, incluidos I40, M41, V44, T48, V78, A79, P80, A83, V84, Q87, V104, S105, D106, L244 y M247, eran residuos comunes que estaban involucrados en todas las interacciones OLP-nsp16 . Para P-16-11, P-16-12, P-16-13, P-16-14 y P-16-15, K38, G39, I40, V44, G77, V78, A79, A83, V84, Q87, V104, S105, D106, L244 y M247 de nsp16 eran residuos comunes en las interfaces de los complejos péptido-nsp16. Los residuos de interacción comunes de nsp14 en todas las interacciones OLP-nsp14 fueron F8, A23, Q22, P24, T25, D126, T127 y T131. Además, V4, L7, F8, P20, T21, A23, P24, T25, H26, C39, V40, D41, F60, K61, M62, N63, Y64 e I201 de nsp14 fueron comunes para mediar en las interacciones de P-14. -11, P-14-12, P14-13, P14-14 y P-14-15 con nsp14.

Los mapas de interacciones de OLP-13 y OLP-18 con sus objetivos (nsp16 y nsp14) indicaron que las interacciones hidrofóbicas fueron las interacciones más abundantes en estos complejos OLP-objetivo (Fig. 4). El N1 de OLP-13 participó en tres enlaces H con A79, D106 y V104 de nsp16. Además, el M5 de OLP-13 formó un enlace H con Q87 de nsp16. El N1 de OLP-13 formó dos enlaces H con T5 y N3 de nsp14. Además, C2 de OLP-13 participó en dos enlaces H con G6 y L7 de nsp14. Se encontraron otros enlaces H entre K4 y L6 de OLP-13 y T25 y D126 de nsp14, respectivamente (Fig. 4a). El N1 de OLP-18 formó tres enlaces H con A79, G77 y V104 de nsp16. C2 y K4 de OLP-18 participaron en enlaces H con D106 de nsp16. K4, M5, C7 y T8 de OLP-18 formaron enlaces H con A83, Q87, L244 y K38 de nsp16, respectivamente. En la interacción OLP-18-nsp14, K4 formó dos enlaces H con D126 y P24 de nsp14. T8 y C2 estuvieron involucrados como donantes en los enlaces H con K61 y P20 de nsp14, respectivamente (Fig. 4b). Los mapas de interacciones para los otros péptidos se muestran en las Figs. S28–S31. Las interacciones hidrofóbicas predominaron en estos complejos péptido-proteína. Además, las fluctuaciones de los residuos en cada complejo de proteína-péptido objetivo durante las simulaciones se muestran en la Fig. S32.

Los mapas de interacciones péptido-proteína para los péptidos OLP-13 y OLP-18 y sus objetivos (nsp16 y nsp14). ( a ) Interacciones péptido-proteína de OLP-13 con nsp16 (izquierda) y nsp14 (derecha) como proteínas objetivo. ( b ) Interacciones péptido-proteína de OLP-18 con nsp16 (izquierda) y nsp14 (derecha) como proteínas objetivo. Las líneas discontinuas negras y los arcos marrones con radios representan los enlaces de hidrógeno y los contactos hidrofóbicos, respectivamente.

Entre los péptidos diseñados, se seleccionaron OLP-13, OLP-18, P-16-11, P-16-13, P-14-14 y P-14-15 con las puntuaciones HADDOCK más negativas para su posterior análisis. (Figura 5). Estos péptidos con mejor puntuación se sometieron a una evaluación adicional después de simulaciones MD de 50 ns utilizando el método MM-PBSA para investigar las energías libres de unión y seleccionar los péptidos más prometedores. Los resultados de MM-PBSA se presentan en la Tabla 3. Los valores negativos de ΔGbinding de MM-PBSA para todos los péptidos analizados indicaron sus afinidades de unión favorables a los respectivos objetivos. P-16-11 y P-14-14 mostraron los valores de ΔGbinding más bajos para nsp16 y nsp14 (−30,4218 y −33,6353 kcal/mol, respectivamente). Tanto OLP-13 como OLP-18 mostraron una mejor afinidad de unión, con una unión ΔG más favorable a nsp16 (−22,4568 y −24,1671 kcal/mol) que a nsp14 (−17,3694 y −19,6176 kcal/mol).

Representaciones de estructuras en 3D de los péptidos diseñados con la mejor puntuación para las proteínas diana (nsp16 y nsp14). Los residuos y péptidos clave que interactúan están coloreados en rojo y turquesa, respectivamente.

Siguiendo los dos pasos de acoplamiento molecular y luego el análisis de energía libre de unión por MM-PBSA, los seis péptidos con mejor puntuación (Fig. 5) se seleccionaron como secuencias peptídicas principales para un análisis integral de mutagénesis de saturación in silico para identificar los péptidos con afinidades de unión mejoradas por investigar los efectos de cada mutación en la afinidad de unión péptido-objetivo diseñada. A este respecto, se generó una gran biblioteca de inhibidores peptídicos con 1539 nuevas secuencias peptídicas al mutar cada residuo de seis secuencias principales a los otros 19 aminoácidos (Tabla S10). La afinidad ΔΔGA positiva del mutante en relación con el tipo salvaje indicó un impacto mejorado de esta mutación en la afinidad del péptido-objetivo. Para OLP-13 y OLP-18, el 17,5 % y el 34,8 % de las sustituciones mostraron una afinidad ΔΔGA positiva con impactos mejorados en las interacciones péptido-nsp16, respectivamente. Sin embargo, solo el 0,06 % y el 0,07 % mostraron una afinidad ΔΔGA considerable (> 0,5 kcal/mol). Para las interacciones OLP-13-nsp14 y OLP-18-nsp14, el 15 % y el 40 % de las mutaciones mostraron impactos mejorados con ΔΔGAfinidad positiva, respectivamente. La mutación de los residuos peptídicos a fenilalanina, triptófano y tirosina mostró los mayores impactos de mejora de estas variaciones en la afinidad péptido-diana con la afinidad ΔΔGA más positiva (color azul). Sin embargo, estos aminoácidos disminuyeron la afinidad de unión predicha en algunas posiciones, como sustituciones en N1, K4 y M5 de OLP-13 o K4 y M5 de OLP-18 en la interacción con nsp16 (Fig. 6a). La mutación de C2 y K4 de OLP-13 en complejo con nsp14 para todos los otros 19 aminoácidos dio como resultado una afinidad negativa de ΔΔGA (colores rojos) con impactos decrecientes, lo que demuestra los roles críticos de estos residuos en la interacción OLP-13-nsp14 (Fig. 6b ). Los mapas de calor que representan la mutagénesis de saturación in silico de otros péptidos principales se muestran en la Fig. S33. Además, para obtener los péptidos inhibidores optimizados, se predijeron las propiedades fisicoquímicas, farmacocinéticas y de toxicidad de los péptidos diseñados. Estas propiedades se dan en detalle en la Tabla S11. La predicción de alergenicidad clasificó los péptidos diseñados como probables alérgenos y probables no alérgenos. Además, el análisis de toxicidad clasificó todos los péptidos diseñados como no tóxicos, excepto P-16-11, P-16-12 y P-16-13.

Mapas de calor que representan el análisis de mutagénesis de saturación in silico de los péptidos inhibidores OLP-13 y OLP-18. (a) interacciones OLP-13-nsp16 y OLP-18-nsp16, y (b) interacciones OLP-13-nsp14 y OLP-18-nsp14. Las mutaciones con impactos mejorados (ΔΔGAfinidad positiva) y decrecientes (ΔΔGAfinidad negativa) en la afinidad de unión del péptido-objetivo se muestran en azul y rojo, respectivamente.

Para identificar los inhibidores peptídicos de pan-coronavirus, se analizó entre los CoV la conservación de los residuos objetivo que se identificaron para interactuar con los péptidos diseñados. El análisis de alineación de secuencias múltiples del nsp16 de siete CoV humanos, es decir, SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-HKU1, HCoV-NL63, HCoV-229E (Fig. S34a), reveló que los residuos de nsp16, incluidos G39, A79, P80, V84, V104, S105 y D106 que interactúan con péptidos, fueron idénticos en estos CoV. I40, M41, T48, G77, V78, A83, Q87, L244 y M247 de nsp16 eran residuos similares. I40 se reemplazó con cisteína tanto en HCoV-OC43 como en HCoV-HKU1 nsp16, y con valina en MERS-CoV nsp16. En nsp16 de MERS-CoV, M41, T48, V78 y M247 se reemplazaron con histidina, metionina, isoleucina y leucina, respectivamente. En HCoV-HKU1, G77 se reemplazó con ácido glutámico. A83 se reemplazó con serina en MERS-CoV y con treonina en HCoV-NL63. En nsp16 de HCoV-NL63 y HCoV-229E, L244 y M247 se reemplazaron con valina y leucina, respectivamente. A continuación, se analizó la conservación del complejo nsp16-nsp10 entre cuatro CoV (SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV y HCoV-OC43) (Tabla S12). G39, T48, V84, S105 y D106 de nsp16 fueron los residuos más conservados con una puntuación de conservación de 9 (magenta oscuro). Otros residuos clave de nsp16, incluidos I40, M41, V44, G77, V78, A79, P80, Q87, V104 y L244, estaban bien conservados, con puntajes de conservación de 6 a 8 (rosa). Entre los residuos investigados, K38 fue un residuo muy variable con una puntuación de 1 (turquesa). A83 y M247 de nsp16 se conservaron de forma intermedia o fueron variables (de blanco a turquesa) (Fig. S34b). El análisis de alineación de secuencias múltiples de nsp14 entre los siete CoV mostró que L7, F8, P20, A23, V40 y F60 de nsp14 eran residuos idénticos. V4, Q22, P24, T25, C39, D41, K61, M62, N63, T127 e I201 de nsp14 eran residuos similares (Fig. S35a). L7, P20, A23, T25 y F60 fueron los residuos altamente conservados con una puntuación de 9 en el nsp14. F8, C39, V40, D41, K61, M62, N63 y T127 estaban bien conservados (con puntuaciones de 6 a 8). V4, Q22, P24, H26, Y64, D126, T131, I201, D41 de nsp14 fueron residuos variables. T21 fue un residuo intermedio (con una puntuación de 5) (Fig. S35b; Tabla S12). Además, los resultados del análisis de conservación de la proteína nsp10 en los CoV se muestran en la Fig. S36 y la Tabla S12.

En este estudio, consideramos los PPI en RTC, centrándonos particularmente en los roles de nsp14 y nsp16 y su cofactor crítico común, nsp10. Las interacciones de nsp10 con nsp14 y nsp16 demostraron su papel activador central en la supervivencia y patogenia de los CoV (Fig. 1a). Apuntar a estos dos IPP es importante en varios aspectos. El gran tamaño del genoma de CoV justifica el requisito de actividad ExoN. La capacidad de RdRp para seleccionar correctamente los nucleótidos es insuficiente para proporcionar fidelidad de replicación, lo que confirma la importancia de la actividad de corrección de nsp14 ExoN74. La interacción de nsp14 con nsp10 fortalece su actividad ExoN hasta 35 veces in vitro75. Además, la interferencia con el último paso del proceso de protección en el SARS-CoV-2 (Fig. 1b) tiene el potencial de bloquear los mecanismos de replicación, traducción y escape viral. Los estudios han demostrado la inhibición de la actividad enzimática de nsp16 en CoV por péptidos derivados de nsp10 del SARS-CoV26 y el virus de la hepatitis de ratón (MHV)27.

Para diseñar los inhibidores de péptidos en el punto de inicio del flujo de trabajo (Fig. S3), se predijeron los residuos clave que median las interacciones de nsp10 con nsp14 ExoN y nsp16 2'-O-MTase (Fig. 2 y Tabla 1). Todos los residuos de interacción clave de nsp14 se extendieron hacia su dominio N-terminal ExoN. Esto indica que es posible que nsp10 no participe en la activación de N7-MTasa y también puede revelar las funciones separadas de los dominios nsp14. Estos resultados estuvieron en consonancia con los estudios que mostraron la función independiente de nsp14 ExoN y N7-MTase por el análisis de hidrólisis76, así como el análisis bioquímico77. Además, los resultados de las simulaciones MD mostraron que una región bisagra separaba los dos dominios de nsp14. Además, las mayores flexibilidades de estas regiones pueden reflejar sus roles en la mediación de los PPI. Debido a la naturaleza dinámica del bucle, los bucles tanto en el terminal N como en el terminal C de nsp10 mostraron una mayor flexibilidad en comparación con otros residuos. Es importante destacar que la comparación de los residuos de interacción clave en estos dos PPI indicó que 24 residuos en nsp10 interactuaron con nsp16 y nsp14 en SARS-CoV-2 (Fig. 2c). Los análisis de mutagénesis y BRET también se han utilizado para mapear las interacciones superpuestas de nsp10 en el SARS-CoV78. La característica única de estos residuos de interacción clave superpuestos sirve como una ventana para apuntar a dos proteínas clave (nsp16 y nsp14) con un inhibidor (OLP). Bouvet et al.78 demostraron que las mutaciones K43A y Y96F en nsp10, denominadas "fenotipo mutador", aumentan las mutaciones del SARS-CoV. Además, las mutaciones de nsp10 disminuyeron o acabaron con la activación de ExoN75. Los resultados del análisis CAS (Fig. S9) son consistentes con estos informes. Los estudios han demostrado que la inactivación de nsp14 ExoN en CoV mitiga la fidelidad de la replicación hasta 20 veces y la ausencia de actividad de ExoN ha mejorado la sensibilidad a la mutagénesis letal en presencia de mutagénesis de ARN79. La explicación de las similitudes y distinciones de los residuos interfaciales y de puntos críticos entre el SARS-CoV-2 y otros CoV (Figs. S6–S8) contribuirá a la preparación futura para posibles nuevos CoV emergentes. Además, este estudio es el primero que predijo los residuos de interacción clave (Fig. S8) y su mapa de interacciones (Fig. S17) y también realizó el análisis de conservación (Tabla S12) en la estructura recientemente informada del HCoV-OC43 complejo nsp16-nsp1033.

Las grandes áreas de interfaz quedaron enterradas tras la formación de los complejos nsp14-nsp10 y nsp16-nap10. Por lo tanto, estas grandes áreas de interfaz con una gran cantidad de residuos de interacción clave demostraron que estos PPI se dirigen a través de péptidos que interfieren en lugar de moléculas pequeñas. Las moléculas pequeñas enfrentan desafíos al participar en estas grandes áreas para competir con la interacción del socio original (nsp10). Además, los mapas de las interacciones de los residuos revelaron los enlaces de hidrógeno complicados y las interacciones hidrofóbicas (Fig. S14), lo que implica que abordar estas interacciones hidrofóbicas con moléculas pequeñas puede ser más desafiante e incluso improbable. Por otro lado, el tamaño más pequeño de los péptidos diseñados en relación con el nsp10 puede proporcionar un beneficio en la unión competitiva debido a que son efectivamente mayores en la concentración en la interfaz y, en consecuencia, mejoran su afinidad.

A continuación, en función de los resultados del análisis de PPI, los inhibidores peptídicos se diseñaron computacionalmente para apuntar a los mecanismos de corrección y protección del ARN en el SARS-CoV-2 (Tablas S6–S8). Luego, se evaluaron los péptidos diseñados (Tabla S9). Entre los OLP, OLP-18 (NCVKMLCT) y OLP-13 (NCVKML) mostraron las puntuaciones de acoplamiento y las energías de unión más bajas, involucraron una gran cantidad de residuos objetivo críticos en las interacciones, mostraron poses de unión adecuadas y propiedades aceptables. Las interacciones péptido-proteína fueron en su mayoría hidrofóbicas (Fig. 4), similares a las interacciones nativas (Fig. S14). No hubo una correlación general entre la longitud del péptido y la energía libre de unión para los péptidos diseñados cuando nsp16 era la proteína diana. Sin embargo, las energías libres de unión de los péptidos cuando el objetivo era nsp14 mostraron una correlación directa con la longitud del péptido (Tabla 2). Además, las puntuaciones de HADDOCK de todos los péptidos analizados fueron más altas que las de las interacciones nativas. Por lo tanto, para identificar los péptidos que se unen más fuertemente con una unión de ΔG cercana o menor que la pareja nativa (nsp10), los péptidos diseñados se optimizaron mediante análisis de mutagénesis de saturación in silico y se generó una nueva biblioteca de péptidos (Tabla S10). Usando este análisis mutacional computacional, se revelaron las sustituciones con la afinidad ΔΔGA más positiva (Figs. 6 y S33). Estos mutantes, como candidatos preseleccionados, lanzan una nueva ronda de estudios computacionales complementarios empleando los métodos descritos en este estudio para evaluar los péptidos recién diseñados. Además, el análisis de conservación reveló la conservación de los residuos objetivo que interactuaron con los péptidos diseñados (Figs. S34 y S35; Tabla S12). Por lo tanto, de acuerdo con la naturaleza conservada de los residuos objetivo, los péptidos diseñados tienen el potencial de funcionar como inhibidores de pan-coronavirus y pueden ser útiles para posibles CoV recién surgidos. Además, los péptidos cíclicos informados en este estudio son dignos de más investigación computacional.

La S-adenosil-l-homocisteína como coproducto de la reacción de la MTasa, la sinefungina y el ácido aurintricarboxílico (ATA) se identificaron como inhibidores de la unión al sustrato nsp16 de los CoV. SAM se utiliza como donante de metilo por varias MTasas celulares huésped. Los inhibidores del sitio de unión a SAM impactan en la actividad de la 2'-O-MTasa del huésped, lo que lleva a efectos citotóxicos inducidos80. En este estudio, se apuntó al sitio único de interacción viral. Por tanto, los péptidos diseñados pueden ser más selectivos y eficaces que los miméticos de SAM. Hasta donde sabemos, actualmente no está disponible ningún inhibidor del péptido nsp14 para CoV, y este estudio representa el primer esfuerzo computacional. La escisión de ribavirina 5'-monofosfato como un análogo de guanosina de los sustratos de ARN por el complejo nsp14-nsp10 explica su escasa actividad contra los CoV. En el fenotipo mutador de nsp14 con inactivación de ExoN, Ribavirin mostró 20081 y Remdesivir mostró una sensibilidad 4,5 veces mayor82. Junto con estos estudios, aquí se sugiere la terapia de combinación de análogos de nucleósidos (NA) con esta primera generación de inhibidores peptídicos diseñados por nsp14 (Fig. 7). Independientemente de las limitaciones del péptido, vale la pena explorar esta estrategia propuesta. Además, se anticipa que la terapia propuesta complementará los efectos antivirales de los NA y podría desencadenar la inhibición tanto de la replicación del ARN como de los mecanismos de corrección del ARN. Además, cuando se desarrolla resistencia a Remdesivir como resultado de mutaciones en RdRp, se prevé que los péptidos diseñados probablemente podrían aumentar la eficacia de Remdesivir sin aumentar el riesgo de resistencia83. Sin embargo, aún se desconocen algunos aspectos importantes desde el punto de vista molecular y bioquímico, y los péptidos diseñados requieren más estudios computacionales y experimentales. Se requiere más investigación para estudiar las actividades de los péptidos propuestos in vitro e in vivo, así como para evaluar su especificidad, eficacia y farmacocinética. Además, al considerar los péptidos diseñados como posibles agentes terapéuticos para pacientes con COVID-19, se sugiere investigar su sistema de administración, en particular las estrategias preferidas de administración, como la subcutánea o la intravenosa, similares a los péptidos aprobados recientemente por la FDA84. Además, para evadir la inmunidad del huésped, los péptidos podrían generarse en pacientes con COVID-19 utilizando ARNm transcrito in vitro (IVT)85.

Esquema que representa la estrategia propuesta para la terapia de combinación de análogos de nucleósidos (NA) con los inhibidores peptídicos diseñados por nsp14 ExoN. Se propone la terapia de combinación de ribavirina, remdesivir u otros NA con los inhibidores del péptido nsp14 ExoN diseñados en este estudio para completar los efectos antivirales de los NA para bloquear tanto la replicación del ARN como los mecanismos de corrección del ARN.

Los CoV han sido la causa de los síndromes respiratorios humanos durante muchos años. La pandemia mundial de COVID-19 ha provocado muchas complicaciones económicas y de atención médica en los últimos años. Esto destaca la importancia de estudiar las bases estructurales y moleculares del SARS-CoV-2 con alta tasa de infección para el desarrollo de vacunas y terapias. Además del reconocimiento del receptor, el estudio de cada punto del RTC y, en particular, de los PPI de las nsp, conduce al diseño de antivirales específicos que interfieren, como los inhibidores de péptidos, con el potencial de dirigirse a un sitio de interacción viral único. La superposición de las interfaces proteína-proteína entre nsp16-nsp10 con actividad de protección y nsp14-nsp10 como guardián de la replicación con actividad de revisión hace que estos PPI sean objetivos prometedores para diseñar antivirales para CoV. Perturbar el paso de formación de SARS-CoV-2 cap-1 tiene el potencial de alterar la actividad de la 2′-O-MTasa y posiblemente hacer que los ARNm virales sean más propensos a ser influenciados por sensores de proteínas clave para iniciar las respuestas inmunitarias más tempranas contra la infección viral. Los sensores celulares, como los receptores tipo toll (TLR), el gen I inducible por ácido retinoico (RIG-I) y la proteína 5 asociada a la diferenciación de melanoma (MDA5) reconocen los ARN que carecen de 2'O-metilo en el primer nucleótido e inducen la señalización cascadas que resultan en la expresión y liberación de citocinas e interferón tipo I16. Este estudio proporciona información completa sobre los residuos clave que median en las interacciones de nsp10 como cofactor dual con nsp16 2′O-MTase y nsp14 ExoN en el SARS-CoV-2 y otros CoV, que son útiles para diseñar nuevas terapias para combatir la actual o futuros CoV. Los resultados de los PPI mostraron que 24 residuos que interactúan son comunes en las interfaces de los PPI de estos complejos. Por lo tanto, se diseñaron, evaluaron y luego optimizaron OLP con potencias inhibitorias duales. La conservación prevista de los residuos clave objetivo ofrece una nueva dirección para diseñar inhibidores de pan-coronavirus. Los esfuerzos para desarrollar y optimizar con éxito los péptidos del estudio actual pueden convertirlos en una nueva generación de candidatos antivirales para el tratamiento de COVID-19 o futuros posibles brotes relacionados.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementaria.

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Las figuras fueron creadas con BioRender (https://biorender.com/). Las figuras 1a y 7 se adaptaron de "Modelo de replisoma de coronavirus putativo" y "Remdesivir: posible candidato a fármaco reutilizado para COVID-19 (retrato)", respectivamente, por BioRender.com (2022). Obtenido de https://app.biorender.com/biorender-templates.

Departamento de Biología y Microbiología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias y Tecnologías Biológicas, Universidad de Isfahan, Isfahan, Irán

Fatemeh Arabi-Jeshvaghani, Fatemeh Javadi-Zarnaghi y Mohamad Reza Ganjalikhany

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FA, FJ y MRG diseñaron el estudio. FA recopiló los datos. FA, FJ y MRG analizaron y discutieron los resultados. FA escribió el manuscrito. FJ y MRG revisaron y revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Fatemeh Javadi-Zarnaghi o Mohamad Reza Ganjalikhany.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Arabi-Jeshvaghani, F., Javadi‐Zarnaghi, F. & Ganjalikhany, MR Análisis de las interacciones críticas proteína-proteína de las maquinarias moleculares de protección y corrección de pruebas del SARS-CoV-2 para diseñar péptidos inhibidores de doble diana. Informe científico 13, 350 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26778-8

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Recibido: 07 Agosto 2022

Aceptado: 20 de diciembre de 2022

Publicado: 07 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26778-8

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